Overview
출처: 박사의 실험실.B 질 벤턴 - 버지니아 대학
모세관 전기 포근 (CE)은 크기와 전하에 따라 전기 장에서 분자를 분리하는 분리 기술입니다. CE는 전해질 용액으로 채워진 모세관이라고 불리는 작은 유리 튜브에서 수행됩니다. 분석물은 전하, 용매 점도 및 크기에 따라 변화하는 전기 전구 이동성의 차이로 인해 분리됩니다. 젤의 전통적인 전기 전경은 줄 가열 효과가 겔과 분리를 망칠 것이기 때문에 적용 될 수있는 전압의 양이 제한됩니다. 모세 혈관은 표면적 대 부피 비율이 커서 열을 더 잘 방출합니다. 따라서 모세관 전기 포근 실험에 적용된 전압은 매우 크고 종종 10,000-20,000 V입니다.
모세관 전기 포근은 고성능 분리에 유용합니다. 액체 크로마토그래피에 비해 CE 분리는 종종 더 빠르고 효율적입니다. 그러나 모세관 전기 포근은 액체 크로마토그래피의 제한이 아닌 충전 된 분자를 분리하는 데 가장 효과적입니다. CE는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)보다 피크 용량이 뛰어나분리가 더 효율적이며 더 많은 피크를 검출할 수 있음을 의미합니다. 계측은 매우 간단할 수 있습니다. 그러나, HPLC는 더 다재다능하고 많은 고정 및 이동 단계는 분자의 다른 모형을 위해 개발되었습니다.
Principles
모세관 전기 포근은 전기 포동으로 인한 분자를 분리합니다. 분자의 전기 전동이동성은 전하와 전압뿐만 아니라 움직임에 저항하는 마찰 항력에 의해 얼마나 끌어당기거나 격퇴되는지에 따라 달라집니다. 마찰은 분자의 반경에 비례합니다. 따라서, 전기 전도 이동성은 크기와 전하를 기반으로합니다. 전하 분자가 모세관을 따라 이동하는 속도는 전기 전동 이동성과 적용된 전기장의 산물입니다. 따라서 전압이 높을수록 속도가 빨라지고 분리속도가 빨라집니다.
대부분의 모세관 전기 포근 계측기는 검출기 끝에 있는 음전압과 입구의 양전압으로 설정됩니다. 이것은 양하전증 분자가 끝에 있는 음극쪽으로 이동하는 것을 의미하고, 부정적인 충전된 분자는 다른 쪽으로 이동합니다. 그러나 모든 분자는 전기 osmotic 흐름이라고 불리는 벌크 유체 흐름이 있기 때문에 검출기에서 볼 수 있습니다. 따라서 마이그레이션 순서는 양전하, 중성 및 음전하 분자입니다.
전기 osmotic 흐름은 염용액으로 채워진 작은 유리 모세관에 고전압을 가하여 발생합니다. 염용액의 양전하 이온은 유리 벽에 음전하 실라놀 그룹이 있는 이중 층을 형성한다. 모세관 의 끝에 음수 전압이 가해지면 이중 층에서 양이온을 끌어당겨 마찰력으로 인해 주변의 용액을 끌어당깁니다. 이러한 유형의 흐름은 플러그 모양이며 HPLC의 포물선 모양의 유동 플러그보다 밴드 가늘게 확장됩니다.
중성 분자는 모두 전기 osmotic 흐름과 동일한 속도로 흐를 수 있습니다. 그러나, 의사 고정 상은 분자가 안팎으로 분할할 수 있는 미셀을 형성하기 위해 실행 버퍼에 첨가될 수 있다. 전형적인 의사 고정 단계는 나트륨 도데킬술페이트입니다. 미셀은 외부에 음전하를 가해, 그래서 그들은 전기 전동 이동성을 가지고, 그래서 미셀에 소요되는 시간은 마이그레이션 시간을 결정합니다. 모세관 전기 포근증의이 형태는 미셀라 전기 키네틱 크로마토그래피 (MEKC)라고합니다.
CE에서의 검출은 HPLC의 경우와 유사합니다. UV-Vis는 일반적이며 분자가 이중 결합을 가지고 있는 한 태그를 지정할 필요가 없습니다. 그러나 흡광도는 50 μm 모세관의 경우 작은 경로 길이에 따라 달라집니다. 버블 셀 또는 z 셀은 경로 길이를 증가시게 됩니다. 레이저 유도 형광은 보다 민감한 검출 방법입니다. 레이저는 모세관의 창과 측정 된 제품의 형광을 통해 빛날 수 있습니다. 형광은 매우 높은 감도를 제공하지만, 대부분은 형광이 아니기 때문에 일반적으로 분자를 태그해야합니다. 전기화학적 검출 및 전기분사 질량 분석 검출이 인기를 얻고 있습니다. 이러한 검출기 중 하나의 문제점은 전기화학및 전기스프레이가 전압의 적용을 필요로 하고 CE 전압이 간섭할 수 있기 때문에 검출 전에 분리로부터 의 고전압을 접지해야 한다는 것입니다. 전극을 사용하여 전류또는 모세혈관의 작은 균열을 배출하는 CE 전압을 분리하는 새로운 방법은 이러한 과제를 극복하고 있습니다.
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Procedure
1. CE 계측 설정
- CE 계측기와 컴퓨터를 켭니다. 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 UV 분석을 위해 광원을 켜서 워밍업할 수 있습니다. 일부 소프트웨어에는 램프가 사용할 준비가 되면 표시등이 있습니다(램프 아이콘이 색상을 바꿉니다).
- 메서드 파일을 만듭니다. CE를 실행하기 위한 중요한 매개 변수를 설정합니다. 이 분석에서 카트리지 및 샘플 저장의 온도는 35 °C입니다. UV 검출을 위한 파장은 214nm입니다.
- 시간 프로그램을 작성합니다. 이 프로그램은 일반적으로 헹구기 단계 (분석 전에 모세관을 청소하기 위해), 주사 단계 및 전기 포근 단계로 구성됩니다. 헹구기 단계의 경우 20 psi의 압력을 사용하여 1 분 동안 2 개의 헹구를 수행하십시오. 첫 번째 헹구는 NaOH와 함께 모세관 벽의 실라놀 그룹이 분해되었는지 확인하는 데 도움이됩니다. 두 번째 헹구는 것은 모세관이 버퍼로 평형상태로 남아 있는지 확인하기 위해 실행 버퍼(0.025 M 붕산버퍼)가 있습니다.
- 주사의 경우, 압력 주사는 5 s에 대한 0.5 psi에서 사용된다.
- 전기 전도 단계의 경우, 조건은 분리 전압입니다 : 20 kV, 시간 : 5 분, 정상 극성. 각 단계에 대해 어떤 바이알이 입구이고 어떤 바이알이 콘센트인지 나타냅니다. 모든 매개 변수를 입력한 후 메서드 파일을 저장합니다.
2. 표준 및 소다 샘플 준비
- 물에 아스파타메, 카페인, 벤조산의 500ppm 스톡 솔루션을 만드세요. 볼륨 플라스크를 사용하여 각각 50mL를 만듭니다.
- 150 ppm 아스파타메, 150 ppm 카페인, 100 ppm 벤조산의 표준 용액을 10mL 체피 플라스크에 만듭니다.
- 10mL 볼륨 플라스크에서 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm 및 200 ppm의 표준 카페인 솔루션을 만듭니다.
3. CE에서 샘플을 실행
- 표준 또는 소다 샘플이 포함된 바이알을 샘플 바이알 홀더에 넣습니다. 어떤 샘플이 슬롯에 있는지 기록해야 합니다. 두 개의 슬롯에는 붕산 실행 버퍼와 0.1 M NaOH 헹구기 솔루션이 있습니다.
- 메서드 파일에서 첫 번째 샘플 바이알이 있는 슬롯을 입력합니다.
- 프로그램이 요청하는 모든 데이터 정보를 입력하여 단일 실행을 획득합니다.
- 데이터를 계속 수집하여 각 샘플에 대한 입력 바이알을 변경합니다. 조합 표준, 카페인의 3 농도, 펩시와 다이어트 펩시 샘플을 실행합니다.
- 계측기에 대상을 삽입하고 적절한 계측기를 선택합니다.
- 컴퓨터의 데이터를 분석합니다. 피크 영역과 오버레이 표준 및 실제 샘플을 계산하여 피크를 식별합니다. 카페인 데이터에 대한 교정 곡선을 만듭니다.
모세관 전기 포근, 또는 CE는, 크기와 전하에 따라 전기 장에서 분자를 분리하기 위하여 화학 분석에 이용된 기술입니다.
모세관 전기 포근은 흐르는 전해질 용액을 포함하는 모세관이라고 불리는 밀리미터 직경의 튜브에서 수행됩니다. 샘플은 모세관에 주입되고 전기장이 적용됩니다. 분자는 그 때 전하, 크기 및 용매의 점도에 의해 영향을 받는 그들의 속도의 차이에 근거하여 분리됩니다. CE는 충전된 분자의 분리에 이상적이며 고성능 액체 크로마토그래피보다 더 큰 해상도를 가지므로 보다 효율적이고 민감합니다.
이 비디오는 모세관 전기 포근의 기초를 소개하고 청량 음료의 구성을 결정하여 사용을 보여줍니다.
CE에서 전기장은 전해질로 채워진 모세관에 적용됩니다. 전기장은 모세관 입구에서 양전하를 유도하고 출구에서 음전하를 유도합니다.
전해질은 전기장에 의해 유도된 모세관 내에서 흐른다. 전기 삼투압 흐름이라고 하는 이 흐름은 음전하 모세관 벽을 따라 양전하 염이온의 이산층의 이동에 기인한다.
전류가 모세관을 통과함에 따라 벽을 따라 양이온이 음의 끝으로 이동합니다. 이 이온 흐름은 튜브를 통해 중앙에 있는 용액을 끌어당깁니다.
샘플 분자는 모세관 내의 속도에 따라 분리됩니다. 전기 전구 이동성이라고 불리는 이 속도는 분자의 전하와 크기, 그리고 전기장에 의해 얼마나 끌리거나 격퇴되는지에 따라 달라집니다.
양전하 분자는 출구의 잠재력에 더 끌리기 때문에 모세관을 통해 더 빨리 흐릅니다. 음전하 분자는 입구의 잠재력에 더 끌리기 때문에 훨씬 느리게 흐를 것입니다. 중성 분자는 벌크 흐름과 함께 운반됩니다. 따라서, 모세관을 빠져나가는 분자의 순서는 양전하, 중성, 그리고 부정적으로 충전된다. 또한 전해질 흐름은 마찰력으로 인해 더 큰 분자보다 더 빠른 분자를 끌어당깁니다.
분자는 자외선-비스와 같은 검출기에 의해 컬럼을 빠져나갈 때 기록되며, 전자페로그램이라고 하는 검출기 신호 강도 대 시간 플롯에서 시각화됩니다.
전기 페로그램은 정보의 범위를 생성 할 수 있습니다; 샘플 및 각 물질의 양에 존재하는 다른 화합물의 수와 같은.
이제 모세혈관 전기포에 대한 간략한 개요를 보았으니 실험실에서 어떻게 수행되는지 살펴보겠습니다.
먼저 모세관 전기포고및 컴퓨터를 켭니다. 그런 다음 UV 검출기를 켜서 워밍업할 수 있습니다.
실험을 실행하기 위한 매개 변수를 설정합니다. 먼저, 카트리지 및 샘플 저장의 온도를 35°C로 설정하고 UV 검출을 위한 파장(214nm)을 설정한다.
다음으로 두 헹도 단계를 설정합니다. 첫 번째 헹구는 것은 모세관 벽의 실라놀 그룹이 양성되도록 수산화 나트륨과 함께합니다. 두 번째 헹구는 데 실행 버퍼를 사용하여 모세관을 양립합니다. 그런 다음 샘플을 5s에 대해 0.5 psi로 주입하도록 설정합니다.
분리 전압을 선택하여 전기 전도 단계를 설정합니다. 이 경우 일반 극성을 사용하여 5분 동안 20kV를 사용하므로 입구에서 전기장이 긍정적이고 콘센트에서 음수가 됩니다.
먼저 탄산음료 성분인 아스파타메, 카페인, 벤조산의 50mL 스톡 솔루션을 100만 개당 500개 부품으로 준비한다.
스톡 솔루션에서 150 ppm 아스파타메, 150 ppm 카페인 및 100 ppm 벤조산의 표준 용액을 만듭니다.
그런 다음 50, 100, 150 및 200 ppm에서 4 개의 표준 카페인 솔루션을 만듭니다. 이러한 샘플은 교정 곡선을 만드는 데 사용됩니다. 자세한 내용은 교정 곡선에서 이 컬렉션의 비디오를 참조하십시오.
마지막으로, 질소로 탈가스를 사용하여 소다 샘플을 준비합니다. 소다 샘플은 희석 없이 분석됩니다.
표준 또는 소다 샘플이 포함된 바이알을 바이알 홀더에 넣습니다. 실행 버퍼와 수산화 나트륨 헹구는 용액을 포함하는 바이알을 샘플 홀더에 배치합니다. 각 위치의 위치를 기록해야 합니다.
CE 계측기 소프트웨어에서 두 개의 헹구는 솔루션과 첫 번째 샘플 바이알이 포함된 슬롯을 나타냅니다. 이제 첫 번째 샘플을 실행합니다.
이어서, 입력 유리병을 변경하여 조합 기준, 카페인 의 4 농도, 및 일반 및 다이어트 소다 샘플을 실행한다.
모든 솔루션이 분리되면 데이터를 분석합니다.
먼저 표준을 사용하여 소다 샘플의 피크를 식별합니다. 다이어트 소다 샘플에서 관찰된 3개의 봉우리들을 기준에 비교하면 카페인, 아스파타메 및 벤조산이 다이어트 소다에 존재한다는 것을 알 수 있습니다. 일반 소다 샘플에서는 카페인 피크만 존재하지만 아스파타메와 벤조산 봉우리는 없습니다.
그런 다음 각 카페인 표준 솔루션에 대한 피크 영역을 계산하고 교정 곡선을 만듭니다. 카페인에 대한 교정 곡선은 각 샘플에서 카페인의 농도를 계산하는 데 사용할 수 있습니다.
모세관 전기 포근은 학술 및 산업 환경에서 많은 전문 분리에 사용됩니다.
CE는 제약 산업 품질 관리 테스트의 한 구성 요소로 자주 사용됩니다. 약물, 작은 분자 또는 생물 제제로, 어떤 측면 제품이 존재하는지 확인하기 위해 모세관 전기 포근을 통해 실행할 수 있습니다. 또한 접이식이 단백질 전하에 영향을 줄 수 있으므로 단백질이 제대로 접혀 있는지 여부를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
CE는 또한 DNA를 분리하기 위하여 이용될 수 있습니다. 마이크로웰 플레이트와 여러 모세 혈관배열을 사용하여 연구자들은 여기에 표시된 것처럼 단일 실험의 처리량을 증가시킬 수 있습니다. DNA 단편은 크기에 따라 분리되었고 해상도는 1개의 기본 쌍까지 내려갔습니다. 이것은 잠재적인 유전 질병을 진단하기 위하여 이용되는 복사 번호 이체 같이 그밖 매개변수를 결정하는 것과 더불어 가능하게 DNA의 단편을 시퀀싱합니다.
단백질은 화학적으로 다른 위치에 부착되는 다양한 기능성 그룹에 의해 변형될 수 있다. 동일한 단백질의 다른 사본은 각 단백질의 전하 및 크기를 바꿀 다른 수정에 따라 다를 수 있습니다. 질량 분광계에 부착된 CE를 통해 정제된 단백질을 실행하면 변형이 존재하는 지 기반으로 단백질을 분리할 수 있으며 수정의 유형 및 위치를 식별할 수 있습니다.
당신은 모세관 전기 포근에 JoVE의 소개를 보았다. 이제 CE가 전하와 질량에 따라 분자를 분리하는 방법과 실험실에서 CE에서 샘플을 실행하는 방법을 이해해야 합니다.
시청해 주셔서 감사합니다!
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Results
다이어트 펩시와 펩시 샘플을 위해 수집된 전기페로그램은 각각 그림 1과 2에도시된다. 카페인, 아스파타메 및 벤조산에 대한 세 가지 피크는 다이어트 펩시에서 관찰되며 표준과 유사한 이동 시간을 가지고 있습니다. 일반 펩시의 경우, 카페인 피크가 존재하지만 아스파타메와 벤조산 봉우리는 아닙니다. CE 분석은 마이그레이션 시간이 3~4분밖에 되지 때문에 빠릅니다.
카페인에 대한 교정 곡선은 그림 3에표시됩니다. 이 곡선은 각 샘플에서 카페인의 농도를 계산하는 데 사용할 수 있습니다.
그림 1. 다이어트 펩시의 CE 분석. 빨간색은 카페인, 아스파타메 및 벤조산의 표준입니다. 검은 색은 다이어트 펩시 샘플입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 펩시의 CE 분석. 검은 색은 펩시 샘플이며 빨간색은 카페인, 아스파타메 및 벤조산표준의 샘플입니다. 아스파타메나 벤조산이 없기 때문에 소다는 식이요법이 아닙니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. CE와 카페인 보정 플롯. 최고 지역의 플롯 대 농도 대 카페인 기준에 대 한 CE로 측정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Applications and Summary
모세관 전기 포근은 많은 특수 분리에 사용됩니다. 예를 들어, 품질 테스트를 위해 제약 산업에서 사용되며 측면 제품이나 간섭자가 없는지 확인합니다. CE는 모세관의 벽이 산성 pH로 중성화될 수 있으므로 모세관에 달라붙지 않기 때문에 기본 아미노산 군으로 약물을 분리하는 데 특히 유용합니다.
CE의 모드는 또한 인간 게놈및 분리된 DNA를 서열화하기 위하여 이용되었습니다. CE의 이 모드는 모세관 겔 전기포광및 이러한 분리를 위해, 중합체가 CE 모세관내로 주입된다. 폴리머는 작은 파편이 젤을 통해 더 빠르게 이동할 수 있기 때문에 크기에 따라 추가적인 분리 모드를 제공합니다. 이것은 체질이라고 하며, 전기전도 분리와 함께 DNA 분석을 위한 1개의 염기 쌍 분해능을 가지고 있다.
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