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Retiro de la sangre

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Colección de la sangre es un requisito común para varios estudios de investigación que involucran a ratones y ratas. La elección del método para el retiro de la sangre en estos animales depende de muchos factores como el volumen de sangre necesitada, frecuencia del muestreo, estado de salud del animal que debe purgarse y el nivel de habilidad del técnico.

Aquí, vamos a revisar estas consideraciones y procedimientos de contorno sangre colección incluyendo el sangrado retro orbital ojo, cola tijeras de hojalatero y mellas, así como la colección de sangre intra cardiaca. Para otros métodos vea el segundo video de esta serie.

Antes de adentrarnos en los protocolos de retirada de la sangre, vamos a repasar primero algunas consideraciones generales como tipo de muestra, selección de agujas y el volumen de sangre máxima que se puede recoger. Antes de recoger la sangre de un ratón o una rata, se determinará el tipo de muestra de sangre necesaria. Procedimientos experimentales pueden requerir sangre entera, plasma o suero.

Si recoger sangre entera, debe agregarse un anticoagulante a la muestra para evitar la coagulación. Anticoagulantes comúnmente usados incluyen heparina, citrato de sodio y ácido de etilendiamina tetraacético, abreviado como EDTA. Anticoagulantes pueden cargarse directamente en la jeringa para recubrir las superficies. Esto permite el contacto de anticoagulante directamente como se extrae la sangre ayudando en la prevención de la coagulación. Porque roedor sangre coagula rápidamente, es esencial utilizar la proporción correcta de anticoagulante a la sangre. Colección de plasma requiere centrifugación de sangre total con anticoagulante. Después de la vuelta, el líquido transparente sobre la capa del CMB y plaquetas es plasma. Contiene fibrinógeno y otros factores de la coagulación. Por otro lado, se obtiene suero de anticoagulantes de sin de muestra de sangre entera. Y porque la muestra se haya coagulado, el suero, que es el mejor jugador, no contiene fibrinógeno ni otros factores de la coagulación.

Selección de la aguja se basa en el tamaño del animal y el sitio de la venopunción. En general, agujas de gran diámetro causan menos daño a las células de la sangre y permiten la recolección de sangre más rápido; pero son más propensos a causar daño a los vasos. Longitud de la aguja se debe considerar también. Si una aguja es demasiado larga, puede ser incómodo de usar, o sangre podría comenzar a coagularse todavía dentro de la aguja. Las opciones de rangos de tamaño de 18 a 29 calibre y 0.5 a 1.5 pulgadas de largo. El tamaño de la aguja adecuada para cada método será discutido en la sección de procedimientos.

Por último, debido al pequeño tamaño de los roedores, hay una cantidad máxima de sangre que se puede recoger en un sorteo de sangre única, que no causará daños graves al organismo. Retiro de la sangre puede ser sin o con el reemplazo flúido - generalmente se hace con solución salina fisiológica 0.9%. El límite máximo en cada caso se encuentra en el protocolo de texto abajo. Además, algunos experimentos requieren la recogida de muestras múltiples y en estos casos junto con el reemplazo flúido animal va a necesitar tiempo entre para reponer las células de sangre. Nuevamente, hay una cantidad máxima que se puede recoger durante la serie recogida y los límites superiores se enumeran en el siguiente protocolo.

Después de revisar algunas consideraciones generales, vamos a saltar en las técnicas de retirada sangre específica, a partir de sangrado retro-orbital - una técnica usada por los científicos para recoger pequeñas cantidades de los vasos cerca del ojo. Tenga en cuenta que la estructura anatómica de la zona orbital es diferente entre el ratón y la rata. Las ratas tienen un plexo de vasos que desembocan detrás del ojo, mientras que el ratón tiene una colección de vasos que crear un retro orbital sino, que lo hace es más fácil de realizar este procedimiento en ratones.

Comenzar agarrando un tubo para recolección de sangre. Se prefieren los tubos de micro hematocrito que 75 50 microlitros. Colocar varias toallas de papel u otros materiales aislantes en la superficie de trabajo. Esto es para mantener el calor del cuerpo del animal durante el procedimiento. Ahora anestesiar al animal con una inhalación de anestésica como isoflurano. Una vez que el animal está anestesiado totalmente, retire de la cámara y coloque sobre su lado que está en posición de recumbency lateral. A continuación, coloque un dedo en la parte superior de la cabeza y a lo largo de la línea de la mandíbula y tire la piel hacia atrás y abajo para inducir la protrusión del ojo. Evite aplicar presión a la tráquea, ya puede causar la muerte por asfixia. Posteriormente, coloque el tubo de micro hematocrito en el canto medial del ojo y dirigen caudalmente en un ángulo de 30 a 45 grados del plano de la nariz. Aplique presión girando suavemente el tubo. Esto corta a través de las membranas conjuntivales y ruptura del plexo ocular o seno. La sangre fluye por acción capilar en el tubo de hematocrito. No empujar el tubo tan profundo que golpeó el hueso en la parte posterior de la cavidad ocular. Una vez que la sangre comience a fluir, mantener la presión para mantener el ojo resaltado. Para detener el sangrado, suelte la piel y deje que el ojo volver a la posición normal. Aplique presión para promover la hemostasia. Para la recolección de muestras repetidas, permiten un mínimo de 10 días entre las hemorragias. Esto proporciona a los tejidos algún tiempo para sanar.

Aunque el sangrado retro orbital es un procedimiento común, hay muchas preocupaciones sobre su humanidad. Estos incluyen hinchazón debido a un movimiento excesivo del tubo de hematocrito. Esto a su vez puede causar la protuberancia del globo ocular e impedir el cierre del párpado resultando en sequedad, daño y dolor, que puede provocar arañazos y uno mismo-mutilación corneal. Colocación inadecuada del tubo de hematocrito puede cortar el nervio óptico dando lugar a ceguera. Otra posible complicación es que el ojo puede ser forzado fuera de la órbita, permitiendo que los párpados a caer detrás del globo ocular. Además, pueden surgir problemas de la fractura de los huesos frágiles de la órbita, penetración del globo ocular dando por resultado la pérdida de humor vítreo, o la formación de un hematoma detrás del ojo que puede causar dolor extremo. A pesar de todas estas preocupaciones, si un técnico especializado realiza el procedimiento y el animal está anestesiado totalmente, sangrado retro orbital es un método eficaz de recolección de sangre en los roedores.

Ahora vamos a repasar las consideraciones y procedimientos para el sangrado de la cola, que permite la recopilación de una serie de muestras de pequeños volúmenes. Los equipos necesitan para este procedimiento incluyen un bisturí estéril número 11. Tijeras deben no utilizarse porque el corte de tijeras es el triturado, que pueden promover la coagulación y reducir el flujo de sangre. Otros instrumentos son un tubo de sujeción que permite el acceso a la cola del animal; toallas de papel absorbente; tubos de colección o hematocrito y polvo hemostático - para facilitar la hemostasia.

Empezar por asegurar el animal en el tubo de retención. Luego, limpie la cola con agua tibia para eliminar la suciedad y provocan ligera vasodilatación. No use agua caliente. Extienda la cola y con la hoja de bisturí cortar el final de la cola para recoger la sangre utilizando tubos hematocrito o colección. La cola puede acariciar o "ordeñada" de ANCA hasta la punta para estimular el flujo sanguíneo. Esto, sin embargo, disminuirá la calidad de la muestra.

Para detener el sangrado, aplique presión en la punta de la cola con una gasa. El polvo hemostático puede utilizarse para conseguir la hemostasia. Compruebe los animales cada 5 a 10 minutos para asegurar la hemostasia se ha logrado, que podría retrasarse después del muestreo repetido. La muestra de un recorte de cola puede contener sangre arterial y venosa, con contaminación de producto tejido. Sin embargo, este procedimiento para recolección de sangre permite colecciones serie interrumpiendo la costra o coágulo del corte original en el extremo de la cola.

Un método de colección de sangre alternativa a un recorte de cola es el nick de vasos de cola, que es relativamente menos invasivo. Para ello, utilizando la misma hoja de bisturí, hacer un corte pequeño directamente sobre la vena lateral de la cola, aproximadamente dos tercios la distancia desde la grupa. Como con unas tijeras cola, sangre puede recogerse en tubos hematocrito o colección. Y es imprescindible para asegurar la hemostasia por presión en el sitio y segunda verificación al animal cada 5-10 minutos. Sin embargo, al igual que con el recorte de la cola, las muestras pueden estar contaminadas con productos de tejido.

A menudo los estudios que requieren una muestra de sangre grande no de supervivencia, que se logra a través exsanguination mediante un sangrado intra cardiaca o la vena cava caudal.

Para método intra cardiaco en ratones, se necesita una jeringa 3 de cc con una aguja de 1 pulgada de calibre 22 -25. Y para las ratas, una jeringa de 10-12 cc con una aguja de 1.5 pulgadas 18 calibre es preferido. Ver el protocolo a continuación para entender el por qué estas necesidades y jeringas son ideales.

Empezar por euthanizing animales usando dióxido de carbono. Después de la eutanasia, sujete el roedor por el pescuezo con el cuerpo colgando verticalmente. Este refrena es importante como el cuerpo debe ser recto para evitar desviación del corazón o una torsión del pecho. Cuenta que el corazón se encuentra aproximadamente a la altura del codo. La inserción es en la muesca justo a la izquierda de la xifoides, paralelo a la espina dorsal y debajo de las costillas.

Introducir la aguja, de bisel, en el pecho y perfore el corazón. Aplicar contrapresión leve con la jeringa. Si la aguja está en el corazón, la sangre fluirá en la jeringa. Espere hasta que la sangre ha llenado el barril antes de agregar la contrapresión adicional. Aproximadamente la mitad del volumen total de sangre se puede recoger de un ratón o una rata por punción cardiaca. Esto es equivalente a aproximadamente 1 mL de sangre de un ratón medio y aproximadamente 10 mL de sangre de una rata promedio

Una posición alternativa es recumbency dorsal al usar el abordaje lateral. En este caso, coloque la aguja entre las costillas en lado izquierdo del animal. El punto de entrada se mide contra el punto del codo en la pared torácica. Introducir la aguja, de bisel hacia arriba, perpendicular al plano de la mesa en un punto a medio camino en la pared torácica. Aplicar ligera presión con la jeringa. Si la aguja está en el corazón la sangre fluirá en la jeringa. Otra vez, espere a que la sangre ha llenado el barril antes de agregar la contrapresión adicional. Tenga en cuenta que en cualquier posición, contrapresión excesiva puede colapsar el corazón ocluyendo el bisel de la aguja y parar el flujo de sangre hacia la jeringa.

Otro método para recoger la sangre cardiaca es a través de la vena cava caudal. El equipo necesario para este procedimiento son una jeringa apropiada con una aguja de tamaño correcto atada; Tijeras para la apertura de la cavidad abdominal, pinzas de pulgar de pequeño atraumáticas y gasa esponja. Esta técnica requiere que el animal profundamente anestesiado y mantenido bajo anestesia durante el procedimiento. Narcosis por CO2 no es una opción, como el corazón animal debe batir para este procedimiento. Coloque el animal en posición dorsal recumbency y garantizar a los miembros a la plataforma. Los miembros deben extenderse lejos del cuerpo.

Ahora Levante la piel con pinzas y utilice tijeras para hacer un pequeño corte transversal a través de la piel justo por encima de la pelvis en las hembras o prepucio en los machos. A continuación, coloque la punta de las tijeras en el corte y haga una incisión de línea media a través de la piel de la pelvis o el prepucio en el xifoides. La piel reflejada lateralmente, levante el músculo y hacer un pequeño corte transversal a través del músculo, justo por encima del corte de la piel.

Coloque la punta de la tijera en el abdomen y realizar una incisión de línea media a través del músculo en el xifoides. No olvide el punto tijera hacia arriba para evitar cualquier órganos de corte de ángulo. Corte transversal a lo largo de la curva de las costillas a cada lado. Tenga cuidado de no pinchar el hígado. Mueva suavemente los intestinos a la izquierda del animal para exponer la vena cava posterior. Coloque una gasa sobre el hígado y descansar el dedo índice y medio sobre él. Con la otra mano, introducir la aguja, de bisel para arriba en la vena cava, a medio camino entre el cruce de los vasos renales y la bifurcación ilíaca. Retire lentamente la sangre mientras se aplica presión sobre el hígado.

Evitar movimiento de la mano, ya podría causar la ruptura del recipiente. También, retiro de la sangre demasiado rápido puede causar la nave a colapsar en el bisel ocluir la apertura y prevención colección de sangre. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad para obtener una muestra estéril porque la aguja no pasa a través de la piel.

Por último, vamos a ver algunas aplicaciones de estas técnicas de retirada de la sangre. Inmuno-Oncología es un campo emergente, y los investigadores en esta área a menudo realizan recogida de sangre para estudiar las células inmunes en las diferentes etapas de desarrollo del cáncer. Por ejemplo, aquí investigadores recogieron sangre cardiaca de ratones portadores de cáncer de aislar y cuantificar neutrófilos en diez, veinte y treinta días después de engraftment de tumor.

Por otro lado, composición de la sangre con frecuencia es estudiado por los fisiólogos. Como en este estudio, los investigadores estaban interesados en la evaluación de la función renal en los animales diabéticos. Para ello, estos científicos primero inyectan un tinte en un modelo animal de diabetes. A continuación, entonces utilizaron método de recorte de cola para recoger la sangre en varios puntos del tiempo para evaluar la concentración de tinte en la sangre, que finalmente fue utilizada para calcular la tasa de filtración glomerular que puso de relieve la diferencia en la función del riñón después de diabetes inducción.

Por último, las células madre investigadores utilizan muestras de sangre para evaluar el éxito de la incorporación de células de un donante en el sistema del destinatario. Aquí, los investigadores primero trasplantan células de médula ósea de un ratón macho en un tipo salvaje y animal femenino genéticamente modificado mediante la inyección de la vena de la cola. A continuación, recolectaron sangre de seno orbital retro del ratón receptor para estudiar el ADN genómico de las células sanguíneas mediante reacción en cadena de polimerasa. Esto proporcionó el porcentaje del engraftment de células de donantes en los dos tipos de animales.

Sólo ha visto primera entrega de JoVE sobre técnicas de retirada de sangre. Por favor vea el siguiente video en serie para examinar cómo llevar a cabo otras técnicas comúnmente empleadas de colección de sangre en animales de laboratorio. ¡Como siempre, gracias por ver!

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