Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education Library
Analytical Chemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 

Chromatographie échangeuse d’ions

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Chromatographie d’échange ionique est employé couramment dans la séparation et l’isolement de composés chargés, biomolécules particulièrement grand.

Ce type de chromatographie en phase liquide utilise une colonne de paniers perles de phase stationnaire, appelé résine. La technique sépare les analytes basée sur leur affinité avec la résine chargée.

Il y a deux types principaux de cette technique. En chromatographie échangeuse de cations, résine de charge négative est utilisé pour lier des analytes chargés positivement. De même, en échange d’anions, charge négative analytes lier à résine chargée positivement. Les composés non liés sont lavés par le biais de la colonne et l’analyte peut ensuite être recueilli dans un récipient séparé.

Cette vidéo va introduire les bases de la chromatographie échangeuse d’ions et démontrer la technique de séparation d’un mélange de protéines dans le laboratoire.

La phase stationnaire est un élément clé pour une séparation réussie. Résines échangeuse de cations forts courses présentent de forts groupes fonctionnels acides, tels que l’acide sulfonique. Résines échangeuses de cations faibles en vedette des groupes vulnérables, tels que les acides carboxyliques.

De même, résines échangeuses d’anions forts utilisent des bases fortes, comme les amines quaternaires, alors que les résines échangeuses d’anions faibles utilisent des amines secondaires ou tertiaires. La sélection de résine dépendra les propriétés du mélange témoin et l’analyte d’intérêt.

Les tampons utilisés, collectivement appelés la phase mobile, sont également importants à une séparation, notamment en termes de pH. Pour les protéines, pH est sélectionnée selon son point isoélectrique, ou pI. À un pH égal à pI de la protéine, la protéine est neutre. Au-dessus de la pI, il aura une charge nette négative, tandis qu’au-dessous de la pI, il aura une charge positive nette. Le tampon pH doit être sélectionné si la protéine est correctement chargé et peut se lier à la phase stationnaire.

Chromatographie d’échange ionique est généralement un processus en quatre étapes. Tout d’abord, une colonne à garnissage contenant une résine échangeuse d’anions ou -cation est équilibrée à l’aide de la mémoire tampon. Il s’agit de colonnes échangeuses d’anions, protonant la résine, s’assurant qu'il est chargé positivement.

Ensuite, l’échantillon est chargé sur la colonne. La mémoire tampon doit avoir faible conductivité, chargée des espèces ne peuvent rivaliser avec l’échantillon pour les interactions avec la résine. Composés de charge opposée se lient à la résine. Les molécules qui ne payent pas, ou qui portent la même charge, restent indépendants.

Dans la troisième étape, la colonne est lavée avec un tampon supplémentaire pour supprimer les composants non liés de la colonne, abandonnant la limite.

Enfin, la quatrième étape est l’élution de l’analyte lié. Ceci est accompli en utilisant un gradient de sel, où la concentration en sel est progressivement augmentée, ou à l’aide d’un tampon d’élution sel élevé.

Les molécules qui sont faiblement liés vont être élués tout d’abord, comme le sel faible perturbera plus facilement leur liaison ionique à la résine. Les composés qui sont plus fortement liés seront éluer avec des concentrations plus élevées de sels.

Maintenant que les bases de la chromatographie d’échange ionique ont été soulignées, permet de jeter un oeil à son utilisation dans la séparation des deux protéines.

Tout d’abord, pour préparer le mélange de protéines pour la séparation, ajouter 0,2 mL de tampon de liaison et de vortex pour bien mélanger. Puis, centrifuger le mélange pour enlever toute la mousse. Pour préparer la colonne échangeuse de cations, il pince verticalement sur un support de bague et laissez la résine s’installer.

Ouvrez le capuchon supérieur de la colonne, puis le bas. Laisser le tampon s’écouler dehors par gravité dans un tube ci-dessous.

Pour préparer la colonne, l’équilibrer en chargeant un colonne-volume de tampon, dans ce cas 0,3 mL. Laisser le tampon de s’écouler hors de la colonne dans un flacon de déchets. Après que vous avez quitté un colonne-volume de tampon, répétez l’étape de l’équilibration.

Pour exécuter l’expérience, placez un tube à centrifuger de 2 mL étiqueté « Unbound 1 » au-dessous de la colonne. Soigneusement charger 0,1 mL de l’échantillon de protéines sur le haut de la colonne.

Une fois que l’échantillon a été chargé, avec un colonne-volume de tampon de lavage et laissez-le s’écouler tout au long. Répéter pour un total de 5 lavages. Collecter chaque lavage dans son propre tube, étiqueté « Unbound 1 » à « 5 ». Pour les 2 derniers lavages, centrifuger la colonne pendant 10 s pour s’assurer que toutes les espèces non liés lavent la colonne. Mettre la colonne dans un nouveau tube de prélèvement de 2 mL Centrifugeuse et étiquette il « Bound 1 ». Charge 1 colonne-volume de tampon d’élution sur le dessus de la colonne. Centrifuger pendant 10 s à 1 000 x g.

Répéter l’étape d’élution 2 fois plus d’assurer la perception de l’analyte lié. Identifier les tubes « Bound 2 » et « 3 ». Enregistrer tous les changements de couleur ou observations sur les fractions.

Dans cet exemple, l’hémoglobine et le cytochrome C, ont été séparés. L’hémoglobine a un pI de 6,8, tandis que le cytochrome C a un pI de 10,5. Dans le tampon pH 8.1, l’hémoglobine est chargée négativement et ne se lie pas à la colonne. À l’inverse, le cytochrome C est chargé positivement à un pH de 8,1 et se lie à la colonne.

L’hémoglobine, une protéine de couleur brunâtre, se trouvait dans les fractions non liées, tandis que le cytochrome C, une protéine de couleur rougeâtre, a été observé dans la fraction liée.

Il existe de nombreuses formes de chromatographie en phase liquide, chacun avec des capacités différentes pour séparer les composants d’un mélange.

Dans cet exemple, chromatographie sur colonne a été utilisée pour séparer un mélange d’ADN bicaténaire simple et double. Hydroxyapatite ou HA, est une forme cristalline de phosphate de calcium utilisent généralement comme une phase stationnaire en raison de ses ions calcium chargé positivement. Dans ce cas, la colonne HA est idéale pour la séparation de l’ADN, car il peut lier au backbone de charge négative de l’ADN.

Une autre forme de chromatographie sur colonne, fréquemment utilisé pour séparer des protéines est la chromatographie d’affinité métallique immobilisée ou IMAC. IMAC, la phase stationnaire possède un ligand avec un ion métallique, qui l’associe à une étiquette histidine sur la protéine d’intérêt.

Tous les autres composants du mélange de sortie de la colonne. La protéine est ensuite éluée avec une solution de l’imidazole, qui a une structure similaire à l’histidine et se lie plus fortement avec l’ion métallique.

Une application courante de la chromatographie sur colonne de chromatographie liquide à haute performance, soit HPLC. HPLC est largement utilisé en chimie analytique pour l’identification et la séparation de composés biologiques et non biologiques dans un mélange.

HPLC est similaire à la chromatographie sur colonne fait preuve dans cette vidéo, sauf que c’est automatisé et fonctionnant à des pressions très élevées. Cela permet d’utiliser de petites perles de phase stationnaire, ayant une surface supérieure à rapport volumétrique. Ainsi, les interactions améliorées entre la phase stationnaire et les composants dans la phase mobile sont possibles.

Vous avez juste regardé introduction de JoVE pour chromatographie échangeuse d’ions. Vous devez maintenant comprendre les concepts derrière elle, les 4 étapes et quelques techniques connexes.

Merci de regarder !

Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter