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Analytical Chemistry

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イオン交換クロマトグラフィー

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イオン交換クロマトグラフィーは、分離と荷電化合物の分離に用いられて特に巨大生体分子。

液体クロマトグラフィーのこのタイプは、樹脂と呼ばれるパックの停滞期ビーズの列を使用します。テクニックは、荷電樹脂親和性に基づく分析を分離します。

この手法の 2 つの主な種類があります。陽イオン交換クロマトグラフィー、負荷電の樹脂を使用して、正荷電の analytes をバインドします。同様に、陰イオン交換で負荷電の analytes は正荷電のガレージにバインドします。列をバインドされていない化合物を洗浄し、別の容器に試料を収集しすることができます。

このビデオはイオン交換クロマトグラフィーの基本を紹介し、研究室では、蛋白質の混合物を分離することによって技術をデモンストレーションします。

固定相は、正常な分離に重要なコンポーネントです。強陽イオン交換樹脂は通常、スルホン酸などの強い酸官能を備えています。弱陽イオン交換樹脂はカルボン酸などの弱いグループを備えています。

同様に、強い陰イオン交換樹脂は、弱陰イオン交換樹脂は、二次または第三アミンを使用して第四紀のアミンのような強い基地を利用します。サンプルの混合物の性質および興味の analyte に樹脂の選択によって異なります。

使用すると、バッファーが特に pH の観点から分離することが重要また移動相を総称です。蛋白質の等電ポイント、または pI に基づく pH を選択します。タンパク質の pI、pH と同じでタンパク質は中立です。上記の pI の純負電荷が pI の下、正味の正電荷が。蛋白質が正しく充電、固定相にバインドすることができるので、バッファーの pH を選択する必要があります。

イオン交換クロマトグラフィーは、一般的に 4 つのステップ プロセスです。まず、いずれかの陰イオンまたは陽イオン交換樹脂を含む充填カラムは、バッファーを使用して平衡です。陰イオン交換カラム、これ protonating 樹脂、それが正荷電を確保する必要があります。

次に、サンプルは、列にロードされます。バッファーは、荷電粒子は樹脂との相互作用のためのサンプルと競うことができる低導電性を持っていなければなりません。反対の電荷の化合物を樹脂にバインドします。満たされない、または同じ電荷を運ぶ分子は、バインドされていないまま。

3 番目のステップでは、列がバインドを残して、列からバインドされていないコンポーネントを削除するのには追加バッファーで洗われます。

最後に、4 番目のステップは、バインドされた試料の溶出です。塩の濃度が徐々 に増大、塩のグラデーションを使用してまたは高い塩の溶出バッファーを使用してによって行われます。

弱くバインドされている分子は、低塩がイオン結合樹脂を妨げる最も簡単に、まず、溶出されます。強くバインドされている化合物より高い塩濃度で溶出されます。

今ではイオン交換クロマトグラフィーの基本が記載されている、2 つの蛋白質の分離の使用を見てみましょうことができます。

まず、分離のため蛋白質の混合物を準備するには、0.2 mL の結合バッファーと混和する渦を追加します。その後、任意の泡を削除する混合物を遠心分離機します。陽イオン交換カラムを準備、リング スタンド クランプで垂直方向に解決する樹脂をできるようにするし、。

列をクリックし、下部のトップ キャップを開きます。以下の管に重力を点滴するバッファーを許可します。

列を準備するには、このケースの 0.3 mL でバッファーの列ボリュームをロードすることによって平衡します。バッファー列の廃瓶を点滴をしましょう。バッファーの列ボリュームの終了後は、平衡の手順を繰り返します。

実験を実行するには、列の下「非連結 1」というラベルの付いた 2 mL 遠心管を配置します。列の一番上に蛋白質のサンプルの 0.1 mL を慎重にロードします。

サンプルが読み込まれた後は、バッファーの列ボリュームと洗って、すべての道を通ることができます。5 洗浄の合計に対して繰り返します。「5」を「非連結 1」というラベルの付いた独自の管で各洗浄を収集します。遠心分離機の 10 列の最後 2 洗浄の s 列をすべての非連結種を洗うことを確認します。新しい 2 mL 遠心管、それ「バインド 1」のラベルの列を置きます。列の上に溶出バッファーの 1 列ボリュームをロードします。10 遠心 1,000 x g で s。

バインドされた試料の収集を確保するため溶出のステップ 2 回を繰り返します。チューブ ラベル「連結 2」と「3」。色の変更や、分数についての観察を記録します。

この例では、ヘモグロビン、シトクロム C が分けられました。ヘモグロビンは、シトクロム C は 10.5 の pI 6.8 の pI があります。 PH 8.1 バッファーでヘモグロビンは負に帯電し、列にはバインドされません。逆に、シトクローム C pH 8.1 で積極的に充電し、列にバインドします。

褐色色のタンパク質、ヘモグロビンは、シトクロム C、赤味がかった着色されたタンパク質がバインドされている割合で観察された、非連結の分数で発見されました。

液体クロマトグラフィー、混合物の成分を分離するための異なる能力を持つそれぞれの多くの形態があります。

この例では、カラム ・ クロマトグラフィは単一および二重鎖 DNA の混合物を分離する使用されました。ハイドロキシアパ タイト、または HA、リン酸カルシウムの結晶の形態は、一般的にその荷電カルシウム イオンによる固定相として使用します。この場合、HA 列が DNA の負荷電のバックボーンにバインドすることができます、DNA の分離に最適でした。

蛋白質を分けるのに頻繁に使用されるカラム ・ クロマトグラフィの別の形態は固定化金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー、または IMAC です。IMAC には、固定相には興味の蛋白質のヒスチジンの札にバインドする金属イオンと配位子が所有しています。

混合物の他のすべてのコンポーネントは、列を終了します。タンパク質は、ヒスチジンに類似した構造は、金属イオンと強く結合するイミダゾール溶液で溶離されます。

カラム ・ クロマトグラフィの一般的な用途は、高速液体クロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーです。高速液体クロマトグラフィーは、識別および混合物の生物的および非生物的化合物の分離分析化学において用い広く。

高速液体クロマトグラフィーは、それが自動化されており、非常に高い圧力で作動させることを除いてこのビデオで示すカラムクロマトグラフィーに似ています。これは容積の比率に高い表面積の小さい定常相ビーズの使用をできます。したがって、移動相の固定相とコンポーネントの改善された対話が可能です。

ゼウスのイオン交換クロマトグラフィー入門を見てきただけ。今それ、4 の手順といくつかの関連技術の背後にある概念を理解する必要があります。

見てくれてありがとう!

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