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腹主动脉瘤的近红外荧光成像

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近红外荧光成像是一种利用荧光探针来可视化组织中复杂生物分子组件的光学技术。这种非侵入性成像技术,也称为NIRF,速度快,不需要电离辐射。

在NIRF中,荧光探针可与小分子结合,提高特异性,研究癌症和心血管疾病的进展。它们被穿透深入组织的近红外光所激发,可用于从改变这些目标分子浓度的病变组织中划定健康组织。

本视频将说明近红外荧光成像背后的原理,以及如何在小型动物中进行体内和体外实验,以研究各种疾病。

顾名思义,近红外荧光成像利用第一个近红外窗口内的光线,范围从650纳米到900纳米,将光子送入组织。目标特异性荧光分子称为荧光道,通常在成像前通过基因工程或注射引入动物。

这些荧光素吸收光子能量,将分子的能量从地面状态S0提高到不稳定的兴奋状态S1素数。由于这种状态是不稳定的,分子会放松到激发状态内的最低振动能量水平,以热的形式释放能量。荧光道,现在处于放松兴奋状态的S1,然后返回到地面状态,发出特定波长的光。

由于当分子松弛到最低振动能量水平时,以热的形式消散的能量,这种光的波长比最初引入荧光的光要长。然后,使用荧光成像系统捕获和记录发射的光。

荧光素的吸收和发射光谱图显示了荧光光能分别吸收和发射的波长范围。这种根本变化,即峰值吸收和峰值发射波长之间的纳米差,称为斯托克斯移位。每个荧光具有独特的斯托克斯偏移,使发射光与刺激光区别开来,使NIRF等成像技术成为可能。

在回顾了近红外荧光成像的主要原理后,现在让我们演练一下准备和成像动物的分步过程。

首先,使用光纤光导将光纤光源连接到荧光成像系统。选择与样品中引入荧光的激发光谱相匹配的激励滤波器,以确保提供正确的光波长。

接下来,选择适当的发射滤波器以匹配荧光的发射光谱,该辐射光谱将阻挡可能归因于自荧光的不需要的光谱成分。

为了开始准备体内成像,使用异物对动物进行麻醉。将动物转移到固定在成像阶段的鼻锥体。固定动物的爪子,以尽量减少运动伪影。涂抹脱毛霜,将头发从感兴趣区域去除。然后,在动物的眼睛上涂上眼膏,防止角膜干燥。

在此之后,将可激活的荧光分子探针注射到动物中。要开始图像采集,打开分子成像软件。同时打开光纤光源和荧光成像系统。

接下来,打开采集窗口并指定适合研究的曝光类型。可用曝光包括用于捕获单个图像的标准曝光、在固定时间间隔内捕获一系列图像的时差曝光,以及逐步曝光以在不同曝光时间捕获连续曝光序列。

然后,选择 UV 透射作为照明源。以预览图像为参考,调整捕获系统室中的对焦、视场和 F 站,以优化采样图像质量。根据需要调整样品的曝光时间和位置。在此之后,关闭预览窗口。确保采集窗口上的所有参数与摄像机和滤镜设置匹配。单击"公开"以获取并保存图像。

为了准备前体成像,在注射荧光探针后,以人道的方式对动物实施安乐死。使用钳子,小心去除任何多余的围周脂肪。接下来,手术提取感兴趣的组织或器官。用磷酸盐缓冲盐水冲洗组织,去除残留血液。然后,将样品直接放在成像阶段。

图像前体组织遵循与在体内成像描述相同的协议。完成后,从舞台中删除示例。关闭系统并清洁成像阶段。

现在,我们已经完成了获取近红外现场图像的协议,让我们来查看这些扫描的结果。

在这些代表性图像中,通过尾静脉系统注入可激活的荧光探针,以可视化基质金属蛋白酶或 MMP2。在这里,我们看到一个体内NIRF图像的脂蛋白-E缺乏小鼠,在注射血管紧张素II后发展出腹部主动脉瘤。虽然大多数小高信号点来自皮肤自荧光,但血管在视觉上表现为具有高荧光信号的管状结构。

第二个代表性图像比较了来自两个不同动物模型的腹部主动脉瘤的NIRF图像。一,一个下腹主动脉瘤在血管紧张素II注入的脂蛋白-E缺乏小鼠。第二,一只注入猪胰腺乳汁酶的大鼠的肾上腺主动脉瘤。

在每一个,我们看到在腹部主动脉瘤区域的MMP2活性增加。多余的荧光探针被过滤和积累在肾脏中,解释在那里观察到的明亮的荧光信号。

现在让我们来看看近红外场成像的其他一些应用。首先,NIRF成像可用于研究鼠模型中的心血管疾病。

在这项研究中,敲除小鼠被注射两种不同的近红外荧光探针。主数在 24 小时后采集,并通过 NIRF 成像进行评估。结果表明,NIRF反应显著,表明存在与巨噬菌体积累共着的粗钙化。

NIRF成像也可用于定位和评估体内肿瘤。在这项研究中,建立了模拟含有荧光肿瘤模拟内含物的乳房幻象的组织。然后模拟NIRF成像在乳房保护手术中的应用。

结果表明,NIRF可检测到肿瘤状内含物,深度约为2厘米。切口进入覆盖的幻象组织后,可检测到比这更深的内含物。去除内含物后,外科医生评估NIRF图像。任何剩余的荧光,表示肿瘤的存在,表示不完全去除,然后被切除。

您刚刚观看了 JoVE 关于近红外成像的介绍。您现在应该了解荧光激发和发射原理,如何准备动物进行体内和外体NIRF成像,以及一些生物医学应用。感谢您的收看!

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