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Imagerie de fluorescence proche infrarouge des anévrismes aortiques abdominaux
 

Imagerie de fluorescence proche infrarouge des anévrismes aortiques abdominaux

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L'imagerie par fluorescence proche infrarouge est une technique optique qui utilise des sondes fluorescentes pour visualiser des assemblages biomoléculaires complexes dans les tissus. Cette technique d'imagerie non invasive, également connue sous le nom de NIRF, est rapide et ne nécessite pas de rayonnement ionisant.

Dans LE NIRF, les sondes fluorescentes peuvent être conjuguées avec de petites molécules pour une plus grande spécificité afin d'étudier le cancer et la progression des maladies cardiovasculaires. Ils sont excités par la lumière proche infrarouge qui pénètre profondément dans les tissus et peut être utilisé pour délimiter les tissus sains des tissus malades qui modifient la concentration de ces molécules cibles.

Cette vidéo illustrera les principes qui sous-tendent l'imagerie par fluorescence proche infrarouge ainsi que la façon d'effectuer des expériences in vivo et ex vivo chez de petits animaux pour étudier une variété de maladies.

Comme son nom l'indique, l'imagerie par fluorescence proche infrarouge utilise la lumière dans la première fenêtre proche infrarouge qui va de 650 nanomètres à 900 nanomètres pour livrer des photons dans les tissus. Les molécules fluorescentes spécifiques à la cible appelées fluorophores sont généralement introduites chez un animal par le génie génétique ou l'injection avant l'imagerie.

Ces fluorophores absorbent l'énergie du photon qui soulève l'énergie des molécules de l'état du sol S0 à l'état instable excité S1 prime. Parce que cet état est instable, les molécules se détendre au niveau d'énergie vibratoire le plus bas dans l'état excité libérant leur énergie sous forme de chaleur. Les fluorophores, maintenant dans l'état détendu excité S1, puis revenir à l'état du sol, émettant la lumière d'une longueur d'onde spécifique.

Cette lumière a une longueur d'onde plus longue que la lumière introduite à l'origine dans le fluorophore en raison de l'énergie qui se dissipe sous forme de chaleur que la molécule se détend au niveau d'énergie vibratoire le plus bas. La lumière émise est ensuite capturée et enregistrée à l'aide d'un système d'imagerie par fluorescence.

Un graphique des spectres d'absorption et d'émission du fluorophore montre la gamme de longueurs d'onde que le fluorophore peut absorber et émettre respectivement. Ce changement fondamental, qui est la différence dans les nanomètres entre l'absorption maximale et les longueurs d'onde d'émission de pointe, est appelé le décalage Stokes. Chaque fluorophore a un décalage distinct Stokes qui permet à la lumière d'émission d'être distingué de la lumière passionnante et rend les techniques d'imagerie telles que NIRF possible.

Après avoir examiné les principaux principes de l'imagerie par fluorescence proche infrarouge, passons maintenant à travers la procédure étape par étape pour préparer et imager un animal.

Tout d'abord, utilisez un guide de lumière à fibres optiques pour connecter une source de lumière à fibre optique au système d'imagerie par fluorescence. Sélectionnez le filtre d'excitation qui correspond au spectre d'excitation de la fluorescence à introduire dans l'échantillon pour s'assurer que la longueur d'onde correcte de la lumière est livrée.

Ensuite, sélectionnez le filtre d'émission approprié pour correspondre au spectre d'émission du fluorophore qui bloquera les composants spectrals indésirables qui peuvent être attribués à l'autofluorescence.

Pour commencer à se préparer à l'imagerie in vivo, utilisez l'isoflurane pour anesthésier l'animal dans une chambre à kobattre. Transférer l'animal sur un cône nasal fixé au stade d'imagerie. Fixer les pattes de l'animal pour minimiser les artefacts de mouvement. Appliquer une crème dépilatoire pour enlever les cheveux de la zone d'intérêt. Ensuite, appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux de l'animal pour empêcher les cornées de sécher.

Après cela, injecter la sonde moléculaire fluorescente activatable dans l'animal. Pour commencer l'acquisition d'images, ouvrez le logiciel d'imagerie moléculaire. Allumez à la fois la source de lumière fibre optique et le système d'imagerie par fluorescence.

Ensuite, ouvrez la fenêtre d'acquisition et spécifiez le type d'exposition approprié à l'étude. Les expositions disponibles comprennent l'exposition standard pour capturer une seule image, l'exposition par laps de temps pour capturer une série d'images sur un intervalle de temps fixe, et l'exposition progressive pour capturer une séquence continue d'expositions à des moments d'exposition différents.

Ensuite, sélectionnez Transillumination UV comme source d'éclairage. En utilisant l'image de prévisualisation comme référence, ajustez la mise au point, le champ de vision et l'arrêt F dans la chambre système de capture afin d'optimiser la qualité de l'image échantillonnée. Ajuster le temps d'exposition et la position de l'échantillon au besoin. Après cela, fermez la fenêtre de prévisualisation. Assurez-vous que tous les paramètres de la fenêtre d'acquisition correspondent aux paramètres de la caméra et du filtre. Cliquez sur "Exposer" pour acquérir et enregistrer l'image.

Pour se préparer à l'imagerie ex vivo, euthanasiez l'animal de façon humaine après l'injection de la sonde fluorescente. À l'aide de forceps, enlever soigneusement tout excès de graisse périortique. Ensuite, extraire chirurgicalement le tissu ou l'organe d'intérêt. Rincer le tissu dans le phosphate tamponné salin pour enlever le sang résiduel. Ensuite, placez l'échantillon directement sur la scène d'imagerie.

Imagedulez le tissu ex vivo suivant le même protocole que décrit pour la formation image in vivo. Une fois terminé, retirez l'échantillon de l'étape. Éteignez le système et nettoyez l'étape d'imagerie.

Maintenant que nous avons terminé le protocole pour l'obtention d'images de champ proche infrarouge, passons en revue les résultats de ces scans.

Dans ces images représentatives, une sonde fluorescente activatable est injectée de façon systématique par la veine de la queue pour visualiser la matrice Metalloproteinase ou MMP2. Ici nous voyons une image in vivo de NIRF d'une souris déficiente d'apolipoprotein-E qui a développé un aneurysm aortique abdominal suivant l'infusion de l'angiotensine II. Tandis que la plupart des petites taches élevées de signal sont de l'autofluorescence de peau, la vascularisation présente visuellement comme structures tubulaires avec des signaux fluorescents élevés.

La deuxième image représentative compare les images NIRF d'anévrismes aortiques abdominaux provenant de deux modèles animaux différents. Un, un aneurysm aortique abdominal suprarenal dans une souris apolipoprotein-E apolipoprotein-E infusée d'angiotensine II. Et deux, un anévrisme aortique abdominal infrarenal dans un rat infusé avec l'élastase pancréatique porcine.

Dans chacun, nous voyons une augmentation de l'activité de MMP2 dans la région anévrismale de l'aorte abdominale. Les sondes fluorescentes excédentaires sont filtrées et accumulées dans les reins, ce qui explique les signaux fluorescents lumineux observés là-bas.

Examinons maintenant d'autres applications de l'imagerie de champ proche infrarouge. Tout d'abord, la formation image NIRF peut être utilisée pour étudier les maladies cardiovasculaires dans les modèles murins.

Dans cette étude, les souris knock-out sont injectées avec deux sondes fluorescentes infrarouges proches différentes. Les aortes sont récoltées 24 heures plus tard et évaluées par imagerie NIRF. Les résultats montrent la réponse significative de NIRF, indiquant la présence de la calcification étendue qui co-localise avec l'accumulation de macrophage.

La formation image NIRF peut également être utilisée pour localiser et évaluer les tumeurs in vivo. Dans cette étude, le tissu simulant des fantômes de sein contenant des inclusions fluorescentes de simulation de tumeur sont créés. Les applications de l'imagerie NIRF pendant la chirurgie de conservation du sein sont ensuite simulées.

Les résultats montrent que les inclusions tumorales sont détectables par le NIRF jusqu'à une profondeur d'environ deux centimètres. Les inclusions plus profondes que cela sont détectables après que les incisions sont faites dans le tissu fantôme superposant. Une fois les inclusions supprimées, le chirurgien évalue les images DU NIRF. Toute fluorescence restante, qui indique la présence de tumeurs, indique l'ablation incomplète et est alors excisée.

Vous venez de regarder l'introduction de JoVE à l'imagerie proche infrarouge. Vous devez maintenant comprendre les principes de l'excitation et de l'émission de fluorophore, comment préparer un animal pour l'imagerie IN vivo et ex vivo DE NRF, et quelques applications biomédicales. Merci d'avoir regardé!

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