Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education Library
Biomedical Engineering

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

Imágenes de fluorescencia infrarroja cercana de aneurismas aórticos abdominales
 

Imágenes de fluorescencia infrarroja cercana de aneurismas aórticos abdominales

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

La fluorescencia infrarroja cercana es una técnica óptica que utiliza sondas fluorescentes para visualizar complejos conjuntos biomoleculares en tejidos. Esta técnica de imagen no invasiva, que también se conoce como NIRF, es rápida y no requiere radiación ionizante.

En EL NIRF, las sondas fluorescentes se pueden conjugar con moléculas pequeñas para una mayor especificidad para estudiar la progresión del cáncer y las enfermedades cardiovasculares. Se excitan por la luz casi infrarroja que penetra profundamente en el tejido y se pueden utilizar para delinear el tejido sano del tejido enfermo que altera la concentración de estas moléculas diana.

Este video ilustrará los principios detrás de las imágenes de fluorescencia casi infrarroja, así como cómo realizar experimentos in vivo y ex vivo en animales pequeños para estudiar una variedad de enfermedades.

Como su nombre indica, las imágenes por fluorescencia casi infrarroja utilizan luz dentro de la primera ventana de infrarrojo cercano que oscila entre 650 nanómetros y 900 nanómetros para entregar fotones en el tejido. Las moléculas fluorescentes específicas de destino llamadas fluoróforos se introducen típicamente en un animal a través de la ingeniería genética o la inyección antes de la toma de imágenes.

Estos fluoróforos absorben la energía del fotón que eleva la energía de las moléculas desde el estado de tierra S0 hasta el estado excitado inestable S1 prime. Debido a que este estado es inestable, las moléculas se relajarán al nivel de energía vibratoria más bajo dentro del estado excitado liberando su energía en forma de calor. Los fluoróforos, ahora en el estado relajado excitado S1, luego regresan al estado de tierra, emitiendo luz de una longitud de onda específica.

Esta luz tiene una longitud de onda más larga que la luz introducida originalmente en el fluoróforo debido a la energía que se disipa en forma de calor a medida que la molécula se relaja al nivel de energía vibratoria más bajo. La luz emitida se captura y se registra mediante un sistema de imágenes de fluorescencia.

Un gráfico de los espectros de absorción y emisión para el fluoróforo muestra el rango de longitudes de onda que el fluoróforo puede absorber y emitir respectivamente. Este cambio fundamental, que es la diferencia en nanómetros entre la absorción máxima y las longitudes de onda de emisión máxima, se denomina desplazamiento De Stokes. Cada fluoróforo tiene un cambio Stokes distinto que permite distinguir la luz de emisión de la luz emocionante y hace que las técnicas de imagen como NIRF sean posibles.

Después de haber revisado los principios principales de la imagen de fluorescencia casi infrarroja, ahora vamos a caminar a través del procedimiento paso a paso para preparar e imaginar un animal.

En primer lugar, utilice una guía de luz de fibra óptica para conectar una fuente de luz de fibra óptica al sistema de imágenes de fluorescencia. Seleccione el filtro de excitación que coincida con el espectro de excitación de la fluorescencia que se introducirá en la muestra para asegurarse de que se entrega la longitud de onda correcta de la luz.

A continuación, seleccione el filtro de emisión adecuado para que coincida con el espectro de emisión del fluoróforo, que bloqueará los componentes espectrales no deseados que pueden atribuirse a la autofluorescencia.

Para comenzar a prepararse para la toma de imágenes in vivo, utilice isoflurano para anestesiar al animal en una cámara de derribo. Transfiera el animal a un cono nasal que esté fijado en la etapa de toma de imágenes. Asegure las patas del animal para minimizar los artefactos de movimiento. Aplicar una crema depilatoria para eliminar el cabello de la zona de interés. Luego, aplica un pomada oftálmica en los ojos del animal para evitar que las córneas se sequen.

Después de esto, inyectar la sonda molecular fluorescente activa en el animal. Para comenzar la adquisición de imágenes, abra el software de imágenes moleculares. Encienda tanto la fuente de luz de fibra óptica como el sistema de imágenes de fluorescencia.

A continuación, abra la ventana de adquisición y especifique el tipo de exposición adecuado para el estudio. Las exposiciones disponibles incluyen la exposición estándar para capturar una sola imagen, la exposición de lapso de tiempo para capturar una serie de imágenes en un intervalo de tiempo fijo y la exposición progresiva para capturar una secuencia continua de exposiciones en diferentes momentos de exposición.

A continuación, seleccione UV Transillumination como fuente de iluminación. Utilizando la imagen de vista previa como referencia, ajuste el enfoque, el campo de visión y el F-stop en la cámara del sistema de captura para optimizar la calidad de imagen muestreada. Ajuste el tiempo de exposición y la posición de la muestra según sea necesario. Después de esto, cierre la ventana de vista previa. Asegúrese de que todos los parámetros de la ventana de adquisición coincidan con la configuración de la cámara y el filtro. Haga clic en "Exponer" para adquirir y guardar la imagen.

Para prepararse para la toma de imágenes ex vivo, eutanasia al animal de forma humana tras la inyección de la sonda fluorescente. Con fórceps, retire cuidadosamente cualquier exceso de grasa periaortica. A continuación, extraiga quirúrgicamente el tejido u órgano de interés. Enjuague el tejido con solución salina tamponada de fosfato para eliminar la sangre residual. A continuación, coloque la muestra directamente en la fase de toma de imágenes.

Imagen del tejido ex vivo siguiendo el mismo protocolo descrito para la toma de imágenes in vivo. Cuando haya terminado, quite la muestra del escenario. Apague el sistema y limpie la etapa de imágenes.

Ahora que hemos completado el protocolo para obtener imágenes de campo de infrarrojo cercano, revisemos los resultados de esos escaneos.

En estas imágenes representativas, una sonda fluorescente activase se inyecta sistémicamente a través de la vena de la cola para visualizar la Matrix Metalloproteinase o MMP2. Aquí vemos una imagen in vivo NIRF de un ratón deficiente de apolipoproteína-E que desarrolló un aneurisma de la aorta abdominal después de la infusión de angiotensina II. Mientras que la mayoría de las pequeñas manchas de señal alta son de autofluorescencia de la piel, la vasculatura se presenta visualmente como estructuras tubulares con señales fluorescentes altas.

La segunda imagen representativa compara imágenes NIRF de aneurismas de la aorta abdominal de dos modelos animales diferentes. Uno, un aneurisma aórtico aórtico suprarrenal en un ratón deficiente de apolipoproteína e de angiotensina II. Y dos, un aneurisma aórtico aórtico infrarrenal en una rata infundida con elastasa pancreática porcina.

En cada uno, vemos un aumento en la actividad MMP2 en la región aneurisma de la aorta abdominal. El exceso de sondas fluorescentes se filtran y se acumulan en los riñones, lo que explica las señales fluorescentes brillantes observadas allí.

Veamos ahora algunas otras aplicaciones de imágenes de campo de infrarrojo cercano. En primer lugar, las imágenes NIRF se pueden utilizar para estudiar enfermedades cardiovasculares en modelos murinos.

En este estudio, los ratones knockout se inyectan con dos sondas fluorescentes de infrarrojo cercano diferentes. Las aortas se cosechan 24 horas más tarde y se evalúan mediante imágenes NIRF. Los resultados muestran una respuesta significativa de NIRF, lo que indica la presencia de una calcificación extensa que coubica con la acumulación de macrófagos.

Las imágenes NIRF también se pueden utilizar para localizar y evaluar tumores in vivo. En este estudio, se crean tejidos que simulan fantasmas mamarios que contienen inclusiones de simulación de tumores fluorescentes. A continuación, se simulan las aplicaciones de las imágenes NIRF durante la cirugía de conservación de mamas.

Los resultados muestran que las inclusiones similares a tumores son detectables por NIRF hasta una profundidad de aproximadamente dos centímetros. Las inclusiones más profundas que esto son detectables después de que las incisiones se hacen en el tejido fantasma superpuesto. Después de eliminar las inclusiones, el cirujano evalúa las imágenes NIRF. Cualquier fluorescencia restante, que indica la presencia de tumores, indica extirpación incompleta y luego se extirpa.

Acabas de ver la introducción de JoVE a las imágenes casi infrarrojas. Ahora debe comprender los principios de excitación y emisión de fluoróforos, cómo preparar a un animal para imágenes IN vivo y ex vivo NIRF, y algunas aplicaciones biomédicas. ¡Gracias por mirar!

Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter