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ラットにおける非侵襲的ACL損傷後の膝関節変性の可視化
 
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ラットにおける非侵襲的ACL損傷後の膝関節変性の可視化

Overview

ソース:リンジー・K・レプリー1,2, スティーブン・M・デイビ1, ティモシー・A・バターフィールド3,4とシナ・シャーバズモハマディ5,

1コネチカット大学キネシオロジー学科、ストールス、CT;2コネチカット大学ヘルスセンター、ファーミントン、CT整形外科3ケンタッキー大学リハビリテーション科学科、レキシントン、KY;4ケンタッキー大学生理学科筋生物学センター、レキシントン、KY;5コネチカット大学生物医学工学部、ストールズ、CT

膝の前十字靭帯(ACL)損傷は、約3分の1の個人がACL損傷後の最初の10年以内に放射線PTOAを実証するので、心的外傷後変形性関節症(PTOA)のリスクを劇的に増加させる。ACL再構成(ACLR)は膝関節の安定性を正常に回復しますが、ACLRおよび現在のリハビリテーション技術はPTOAの発症を妨げありません。したがって、ACL損傷は、外傷性関節損傷後のPTOAの発症を研究するのに理想的なモデルを表す。

ラットモデルは、PTOAに対するACL損傷の発症および影響を研究するために広く使用されている。ACL損傷の最も広く使用されているモデルはACL切除であり、これは関節を外科的に不安定にする急性モデルである。実用的であるが、このモデルは、傷害に対する天然の生物学的応答を隠す侵襲的および非生理学的傷害手順によるヒトACL傷害を忠実に模倣しない。結果の臨床翻訳を改善するために、我々は最近、脛骨圧縮の単一の負荷を介してACLが破裂するACL傷害の新しい非侵襲的モデルを開発しました。この傷害は人間に関連する傷害条件を密接に複製し、非常に再現可能である。

マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)による関節変性の可視化は、関節全体の変性の急速な、高分解能、非破壊的な3Dイメージングを含む従来のOA染色技術に対するいくつかの大きな進歩を提供します。このデモンストレーションの目的は、げっ歯類モデルで最先端の非侵襲的ACL傷害の状態を導入し、μCTを使用して膝関節変性を定量することです。

Principles

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ACLは、脛骨の前部間角膜空間から生じる密な結合組織のバンド状の構造であり、大腿骨の側面の後部に上および横に延びる。構造的には、ACLは膝の受動安定剤の両方として機能し、他の靭帯と協調して働き、動的運動中の関節を制御するのに役立ちます。ACLは前脛骨変位に対する主要な拘束であり、膝関節の安定性を維持する上で重要な役割を果たします。構造的な支持を超えて、ACLはまた膝関節と中枢神経系との間の神経情報のための経路として機能する。ACL の最大のストレスは、膝が延長に近い場合に発生し、ACL が怪我の危険性が最も高いのはこの間です。

ACLは、スポーツや仕事に関連する活動中に最も一般的に負傷した膝の靭帯です。非接触 ACL 傷害は、すべての ACL 傷害の約 70% を占めており、ACL の過剰な読み込みにつながる十分な力や膝の瞬間を生成するときに発生します。非接触ACL傷害のメカニズムは、様々な研究モデル(前向き、回顧的、観察、生体内およびインビトロ)を使用して調査されていますが、傷害がどのように起こるかの直接的な決定は依然として不明瞭なままです。ACLの再構成は、多くの場合、個人ハムストリングまたは膝蓋腱の一部をACLの領域に外科的に挿入することによって行われる。外科的再建の目的は、損傷後に失われた膝の安定性および機能能力を最大化することである。外科的再建はスポーツへの安全な復帰を促進し、長期的な膝関節の健康を促進する。しかし、臨床医や研究者の最善の努力にもかかわらず、再建されたACLを持つ患者のほぼ3分の2は、再建後12ヶ月で活動に戻らず、再建されたACLの50%以上が傷害後5〜14年後にPTOA 5-14年の放射線徴候を有する。

動物モデルは、関節の健康に対する治療の自然史と応答を研究するための実用的かつ臨床的に関連する方法の両方を提供します。重要なことに、ラットの膝はヒトの膝と同様の解剖学的構造を有し、ラット膝はACL損傷後にPTOAを研究するのに有用なモデルとなる。結果の臨床翻訳を改善するために、我々は最近、ACLが脛骨圧縮の単一の負荷を介して破裂するACL傷害の新しい非侵襲的モデルを開発しました。この傷害は人間に関連する傷害条件を密接に複製し、非常に再現可能である。

ロード デバイスは、2 つのカスタムビルドの読み込みプラットフォームで構成されています (図 1)。トップ膝ステージは、直鎖状アクチュエータ(DCリニアアクチュエータL16-63-12-P、Phidgets、アルバータ州、CA)に剛性に取り付けられ、右後肢を30°1-3のドーシフレクションと100°1の膝屈の位置に配置し、脛骨に対する脛骨の前部サブラックスの余地を設けています。下の段階は屈曲した膝を握り、ロードセル(HDM社、PW6D、サウスフィールド、MI)の真上に取付けられる。傷害の間、ラットは麻酔され、次いで右後肢は8mm/s.1 ACL損傷の速度で脛骨圧縮の単一負荷を受け、カスタムプログラム(LabVIEW、ナショナルインスツルメンツ、オースティン、TX)を介して監視される傷害中の圧縮力の放出によって注目される。外傷後、ACL破裂はラクマンの検査によって臨床的に確認され、前向きの力が脛骨に加えられる間に大腿骨が確保される。前脛骨変換が過剰な場合は、ACL の欠乏を示します。ACLの傷ついた後肢は膝関節の変性を視覚化するためにカスタム3Dプリント装置で延長され、固定することができる。PTOA開発に関連する経角構造の変化を特徴付けるために画像を取得します。4

Figure 1
図1:単離された非侵襲的ACL損傷を引き起こす脛骨圧縮負荷。

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Procedure

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非侵襲的ACL傷害

  1. 適切な個人保護具を着用してください。呼吸マスクを使用できますが、このプロトコルでは必須ではありません。
  2. 5%のイソフルランと1 L/分の酸素を有する誘導室を使用してラットを麻酔する。1-3%のアイソフルランと500 mL/minの酸素を持つ鼻コーンを介して麻酔の流れを維持します。装置がバックドラフトまたはダウンドラフトテーブルに設定されていない場合は、テーブルトップシステムとチャコールフィルターを使用して廃ガスが清掃されていることを確認してください。
  3. つま先ピンチを実行して、十分な麻酔深度に達していることを確認します。注意してくださいプロトコルはすぐに実行される目の潤滑剤を適用する必要がなく(< 3分)、角膜の乾燥のリスクは最小限です。
  4. 大腿骨に対する脛骨の前部亜脱臼のための余地を提供しながら、ドーシフレキションの30°と膝の屈曲の100°で右後肢を配置します。
  5. 上部の膝の段階をリニアアクチュエータにしっかりと取り付けます。
  6. 曲げ膝を下段に置き、ロードセルの真上に取り付けます。
  7. 8 mm/s の速度で脛骨圧縮の単一負荷を使用して ACL 傷害を誘導します。
  8. ACL傷害は圧縮力の解放によって注目される。これは、カスタム プログラムを介して監視されます。
  9. 外傷後、動物がまだ麻酔の下にいる間に、ACL破裂が起こったことを臨床的に確認するためにラフマンの検査を行う。Lachmanのテストは、矢状計画の安定性を評価することによってACLの完全性を評価するために使用される臨床試験です。大腿骨を安定させながら、脛骨を前方(前方向)に引っ張り、運動量を評価します。無傷のACLは、研究者が脛骨を前方に翻訳することができない「しっかりしたエンドフィール」を生成します。負傷した ACL は、ACL が破れた可能性を示す「ソフトまたはムッシュなエンドフィール」を生成します。
  10. 大腿骨と脛骨を触診して骨の大きな損傷を検出します。禁忌が確認されていない場合は、動物をケージに移し、回復を可能にする。この間、動物を監視して、動くことを嫌ったり、発声したり、異常な姿勢を示したりするなど、痛みの兆候が現れないことを確認します。

関節変性の>CTイメージング

2-D画像は、70 kV、電流85.5μAのスキャナ設定を使用して得られます(図2B)。データは完全な180°を通して11.5 μmの分解能で0.6°回転ステップごとに収集される。断面画像は、平滑化されたバックプロジェクション アルゴリズムと再構築されたイメージのスタック上に再構築されます (図 2C)。次に、ソフトウェアのセグメンテーションによってトラベキュラ構造が解析され、1.53mm球が内側および横脛骨高原のエピフィシャルプレートの中心に配置され、経角厚さ(μm)、軌道分離(μm)、および軌道数(1/mm)を決定します。5、6

  1. ACL後4週間の傷害で、誘導室内のCO2への長時間の暴露でラットを安楽死させる。
  2. カスタム 3D プリント デバイスで負傷した ACL の延長とセキュリティ保護 (図 2A)。
  3. μCTを使用して画像を取得します。
  4. 正面平面のX線写真を取得して、ジョイントスペースを決定します。傷ついた四肢と比較して(大腿骨のコンダイルと脛骨高原の間(mmで測定)狭窄。
  5. 70 kV および電流 85.5 μA のスキャナー設定を使用して、2-D イメージを取得します。
  6. 完全な180°を通して11.5μmのピクセルサイズで0.6°回転ステップごとにデータを収集します。
  7. 再構築された画像のスタック上の平滑化されたバックプロジェクションアルゴリズムを使用して、断面画像を再構築します。
  8. 一貫した対象領域を測定するには、内側および外側脛骨高原および大腿骨のエピフィシールプレートに1.53mm球を配置して、経角厚さ(μm)、軌道分離(μm)、および軌道番号(1/mm)を決定します。

Figure 2
図 2:A)μCT、B)2次元画像、およびC)3-D μCTの間に後肢を保持するカスタム印刷装置。

最も一般的な膝の外傷の1つは、ACLとも呼ばれる前十字靭帯の破裂または裂け目であり、ACL損傷のほぼ3分の1が10年以内に外傷後変形性関節症(PTOA)をもたらす。

ラットの膝関節は人間の膝関節に近いモデルであるため、ラットモデルはPTOAに対するACL損傷の影響を研究するために広く使用されています。ACL損傷の最も広く使用されているモデルは、関節が外科的に不安定化するACL切除である。しかし、このモデルはヒトのACL傷害条件を正確に複製しない。

本ビデオでは、新規の非侵襲的ラットACL傷害モデルについて議論し、損傷した関節の損傷とイメージングを実証し、最後に靭帯修復に関する生物医学工学分野の研究を検討する。

膝は、大腿骨、膝蓋骨、脛骨の3つの骨からなる。前十字靭帯(ACL)は、脛骨の前部角膜空間から上昇し、大腿骨の側面の後部に上および横に延びる密結合組織のバンド状の構造である。

膝の他の靭帯には、後十字靭帯、側側副靭帯、および内側側副靭帯が含まれる。構造的には、すべての靭帯、特にACLは、動的運動中の関節を制御するのに役立つ大腿筋肉と一緒に膝の受動安定剤として機能します。

ACL の最大のストレスは、膝が延長に近い場合に発生し、ACL が怪我の危険性が最も高いのはこの間です。動物モデルは関節の傷害および処置を研究する実用的で臨床的に関連する方法の両方を提供する。特にラット膝モデルは、ラット膝が人間の膝によく似ているため、膝の損傷を研究するために広く使用されています。ヒトにおける臨床的に関連するACL傷害をモデル化するために、脛骨圧縮の単一の負荷が適用される。正しく行われると、ACL が完全に破裂します。

ACLで損傷した後肢は、マイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)を使用して画像化し、関節損傷や変性を可視化することができます。マイクロCTは、X線を使って関節のような物体の画像を作成するイメージング技術です。これらの断面は、オブジェクト全体で測定され、組み合わさって 3 次元再構成を作成します。マイクロCTの詳細については、このコレクションのビデオをご覧ください。

新しい非侵襲的なラットACL傷害モデルについて説明したので、怪我がどのように行われるかを見て、続いて関節のマイクロCT可視化を見てみましょう。

ACL傷害は、麻酔ラットの脛骨に圧縮の単一の負荷を誘発するカスタムデバイスを使用して行われます。まず、5%のアイソフルランと1分間の酸素を持つ誘導室にラットを置きます。麻酔ができたら、鼻コーンを使用してラットを装置に移動し、1~3%のイソフルランの流れを維持します。右後肢を30度のドーサフレクションと100度の膝の屈曲に置きます。

リニアアクチュエータに取り付けられた上部膝ステージを毎秒1ミリメートルで動かします。大腿骨に対して、脛骨の前部亜脱臼のためのスペースを提供することを確認してください。次いで、曲げ膝を下段に置き、ロードセルの上に向けた位置に取り付けられる。ラットが正しく配置されたら、カスタム デバイスの電源を入れ、ラボ ビューを開き、1 秒あたり 8 ミリメートルの圧縮速度を入力します。次に、脛骨圧縮の単一負荷を使用して ACL 破裂を誘発するテストを実行します。テストを実行するときに、手順を監視します。ACLの傷害は圧縮力の解放によって注目される。

怪我をした後、デバイスからラットを取り出し、平らな面に置きます。次に、Lachman のテストを実行して ACL の整合性を評価します。大腿骨を安定させながら、脛骨を前方に引っ張ります。無傷の ACL はしっかりとしたエンドポイントを生成し、負傷した ACL はソフト エンド フィールを生成します。ラッハマンのテストが行われたら、麻酔から目を覚ますためにラットをハウジングに戻します。

それでは、損傷した関節をイメージしてみましょう。マイクロCTイメージングを準備するには、AVMAガイドラインに従ってラットを人道的な方法で安楽死させる。その後、いくつかのプラスチック製のジップタイを使用してACLで負傷した後肢を拡張し、固定し、慎重にカスタムデバイスにそれらを操縦します。後肢は円錐管内で完全に伸ばすべきである。

残りのラット本体を、マイクロCTステージと互換性のある適切な容器に固定します。次に、固定されたジョイントをマイクロCT機器に配置し、85.5マイクロアンストロームの電流で70キロボルトのスキャナ設定と180度の解像度11.5ミクロンの解像度を使用して、関節の骨の2次元画像を取得します。0.6 度回転で 5 秒の露光時間を使用します。2次元画像を収集し、180度全体を通して0.6度ごとに回転させます。次に、アルゴリズムを使用して画像を再構築し、ジョイントの 3 次元画像を作成します。経角骨の特性を決定するには、まずソフトウェアプラグインを使用してジョイントのボリュームレンダリングを取得します。

次に、直交投影を表示し、スライスを移動して、内側と側面の脛骨高原のエピフィシャルプレートと大腿骨の内側と側面の結節の間の所望の位置を選択します。次に、目的の位置で膝をトリミングし、1.53ミリメートルの球でマスクします。インタラクティブしきい値を使用して、ボーンにラベルを付け、イメージをバイナリ化します。さて、変形性関節症の発症の測定である経電性骨の厚さを計算する。

異なる場所に対して繰り返し、他の管状の骨の特性を定量化します。イメージング後、目視検査や膝を開いてACLの破裂を確認することができます。これを行うには、まずスキンを削除します。カプセルに血液があり、ACL傷害の特徴であるヘマールスロシスを見る必要があります。

次に、関節を開けて前位大腿骨、膝蓋骨、ACL を公開します。ロッホマンのテストを実行して関節をさらに開き、関節の血液とACLの孤立した近位裂を観察します。

さて、ラット膝の関節変性と血管骨構造を急性ACL損傷とラット膝4週間後のACL損傷と比較してみましょう。ここでは、急性ACL損傷を伴うラット膝の再構築された3D画像を見て、4週間後にACL傷害後に。経電骨の厚さ、数、および間隔は、エピフィシールプレートの中心にある4つの異なる位置で計算され、比較されます。

より小さい特徴的な数、より小さい形面の厚さ、およびより大きな特徴的な間隔は、急性ACL損傷を有するラット膝と比較して、非侵襲的ACLの涙の4週間後に明らかであった。これらはいずれも、心的外傷後変形性関節症の発症の特徴である。

様々な動物モデルは、ACL傷害の研究だけでなく、新しい治療法を評価するためにも重要です。ACL損傷の現在の治療法の1つは、組織移植片を用いた靭帯再建である。本研究では、ポリカプロラクトンを用いて線維組織移植片を作成した。その後、細胞移植片をラットに移植し、自然靭帯を置き換えた。

大腿骨と脛骨台に穴を開け、穴を通して移植片を通過し、縫合糸で固定することにより、移植片を膝関節に固定した。16週間後、組織学的分析は、足場マトリックスが線維芽細胞によって浸潤し、ポリマーが残っている証拠がほとんどなく、主に再吸着されたことを示す。設計靭帯はまた、インビトロで研究することができます。

本研究では、ヒト細胞をACL残骸から単離し、培養を拡大した。その後、細胞をアンカーで被覆プレート上で培養し、操作靭帯構造を形成した。フィブリン形成を奨励するためにフィブリノーゲンを添加した後、プレートをインキュベーターで培養した。

28日後、フィブリンは2つのアンカーの間に線形組織を形成した。このタイプの研究は、研究者がさまざまなタイプの成長因子とホルモンの役割を理解し、ACL置換組織を合成し、生体内でACL修復を奨励する方法を決定することを可能にする。

あなたは、ACLの傷害を誘発し、視覚化するためにラットモデルの使用に関するジョーブの導入を見たところです。ここで、ラットモデルを使用して靭帯損傷の研究と画像化に使用する方法と、この研究分野のいくつかの応用を理解する必要があります。

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Results

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より小さい経電数は、トラベクチュラの厚さとより大きな運動間隔、PTOA発症のすべての特徴的な特性、非侵襲的ACL裂傷の4週間後に明らかであった(表1および図3)。健康な四肢と急性の負傷した四肢の解剖ACLの画像を図5に示す。ACLが脛骨圧縮の単一の負荷を介して破裂するACL傷害の新しい非侵襲的モデルは、ACLの孤立した近位の涙を作り出すことができた。

Figure 4
図3:ラットにおける急性ACL損傷(左)および4週間後ACL損傷(右)の3次元再構成されたμCT画像。

表1: PTOA発症の特性測定値

動物 Tb.N
(1/mm)
Tb.Th
m)
TB.Sp
m)
急性ACL負傷 3.11 168.5 217
ACL後の4 wks 2.63 166.7 213

Figure 5
図4:急性の負傷したACL-limb(左)の画像と、無傷で健康なACLの画像(右)。

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Applications and Summary

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このビデオでは、リニアアクチュエータを使用してラットで孤立した非侵襲ACL破裂を生成する方法を示します。この傷害は人間に関連する傷害条件を密接に複製し、非常に再現可能である。従来のOA染色技術のいくつかの主要な制限を克服するために、この方法は、全体の関節変性および形質構造を定量するためにμCTを使用する。

筋骨格リハビリテーションの結果を改善するためのエビデンスに基づく介入は、基本的な生物学の大幅な進歩がリハビリテーションへの変更を示唆しているにもかかわらず、過去20年間でほとんど変化していない非常に重要な領域ですプロトコルの期限が長いです。問題は、古典的なリハビリテーションの専門家が、クリニックに翻訳する前にモデル生物でテストされる情報に基づいた仮説を提供するために、基礎科学ではなく臨床実践を形成するために逸話的なレポートを使用していることです。ここで説明する手順は、ヒトに関連する外傷性関節損傷を密接に複製し、関節の健康の進行を追跡するためにμCTを使用する方法を科学者に提供する。

材料リスト:

機器 会社 カタログ番号 コメント
リニアアクチュエータ フィドゲス L16-63-12-P
ロードセル 株式会社HDM PW6D
μCt ツァイス XRM XRADIA 520

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References

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  3. Lockwood KA, Chu BT, Anderson MJ, Haudenschild DR, Christiansen BA. Comparison of loading rate-dependent injury modes in a murine model of post-traumatic osteoarthritis. J Orthop Res. 2014;32(1):79-88.
  4. Blair-Levy JM, Watts CE, Fiorentino NM, Dimitriadis EK, Marini JC, Lipsky PE. A type I collagen defect leads to rapidly progressive osteoarthritis in a mouse model. Arthritis Rheum. 2008;58(4):1096-1106.
  5. Mohan G, Perilli E, Kuliwaba JS, Humphries JM, Parkinson IH, Fazzalari NL. Application of in vivo micro-computed tomography in the temporal characterisation of subchondral bone architecture in a rat model of low-dose monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 2011;13(6):R210.
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