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Clasificación de células activadas por citometría de flujo y fluorescencia (FACS)
 

Clasificación de células activadas por citometría de flujo y fluorescencia (FACS): Aislamiento de linfocitos B esplénicos

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El sistema inmunitario protege al cuerpo de los patógenos invasores mediante la generación de leucocitos, también llamados glóbulos blancos. Cuando un patógeno infecta con éxito un organismo, se activa una amplia variedad de leucocitos y esta reacción coordinada se denomina respuesta inmunitaria.

Con frecuencia, es útil para los investigadores ser capaces de identificar el tipo específico y el número de células inmunitarias que se han activado en respuesta a un patógeno. La citometría de flujo es una técnica que permite a los investigadores separar las células en función de epítopos específicos expresados en sus superficies. Esto se logra utilizando anticuerpos monoclonales etiquetados con fluorocromo que se unen a epítopos específicos de células inmunitarias conocidos, y tras la excitación, estos fluorocromos enlazados emiten una longitud de onda de luz que puede ser detectada y puntuada por un citómetro de flujo.

Los citometros de flujo se componen de tres sistemas. El sistema fluido transporta las células en una corriente de tal manera que pasan delante de un láser uno por uno. El sistema óptico está compuesto por láseres y detectores que reconocen la presencia o ausencia de los fluoróforos. Por último, el sistema electrónico convierte los datos ópticos recogidos en archivos electrónicos para su análisis.

Una extensión de la citometría de flujo es el Clasificador de Células Activado por Fluorescencia, o FACS, que permite el enriquecimiento de poblaciones celulares específicas para que puedan ser estudiadas de forma independiente. La clasificación celular se realiza utilizando una boquilla vibratoria dentro de la corriente fluida que forma microgotas, cada una de las cuales contiene una sola célula. Luego, un detector determina si la luz fluorescente se emite o no de cada gota, y en base a esa información, un electroimán da a cada célula una carga negativa o positiva. A continuación, un campo eléctrico fuerte ordena las gotas cargadas de manera diferente en contenedores separados. En última instancia, uno de los contenedores contendrá una población homogénea de células basada en la expresión de una molécula de superficie celular específica.

En este video, aprenderás a usar citometría de flujo para aislar leucocitos del tejido del bazo del ratón y FACS para seleccionar linfocitos B.

Para empezar, ponte guantes de laboratorio y la ropa protectora adecuada. A continuación, lave un par de tijeras dissección y fórceps primero con detergente y luego con 70% de etanol y luego séquelos con una toalla de papel limpia.

Luego, agregue 49 mililitros de solución de sal equilibrada de Hank, o HBSS, a un tubo de 50 mililitros. Agregue un mililitro de suero de becerro fetal, o FCS, para crear una solución de FCS HBSS 2% y mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces.

A continuación, coloque un ratón eutanasiado en la posición supina en una placa de disección. Con las tijeras y fórceps, realice una laparotomía longitudinal para acceder a la cavidad abdominal. Use los fórceps para mover los intestinos del lado derecho del abdomen a un lado para exponer el estómago y el bazo. El bazo está unido al estómago. Luego, con una pipeta, coloque cinco mililitros del HBSS 2% FCS en una placa Petri. Con fórceps, separa cuidadosamente el bazo del estómago y coloca el bazo en la placa De Petri.

Para aislar las células inmunitarias, coloque primero el bazo en un colador de células de 40 micras en un plato de Petri. Aplastar el bazo con un émbolo para disociarlo en el plato. Luego, pipetee el bazo disociado y el líquido de la placa Petri en un tubo centrífugo de 15 mililitros. Centrifugar el tubo a 370 veces g durante siete minutos a 10 grados Centígrados y luego recuperar el tubo con cuidado para no molestar el pellet.

Ahora, retire el sobrenadante, evitando el pellet, y deseche el líquido en un contenedor de residuos apropiado. A continuación, agregue dos mililitros de tampón de levas ACK en el tubo de centrífuga para resuspender y lise los eritrocitos. Espere dos minutos y luego agregue HBSS 2% FCS para obtener un volumen total de 15 mililitros. Repite la centrifugación. Recupere el tubo con cuidado y deseche el sobrenadante. Resuspenda el pellet de nuevo en cinco mililitros de HBSS 2% FCS.

Para contar las células resuspendidas, diluya cinco microlitros de la suspensión celular con cinco microlitros de Trypan Blue. A continuación, deposite suavemente una gota de cinco microlitros de esta suspensión de celda diluida entre el vidrio de cubierta y la corredera Malassez. Ahora, bajo un microscopio con aumento 40X, cuente el número de células presentes. Luego, ajuste la concentración celular a 10 a las séptimas células por mililitro agregando el volumen apropiado de HBSS 2% FCS.

Para manchar las células inmunitarias, comience por etiquetar seis tubos FACS del uno al seis. A continuación, transfiera 200 microlitros de la solución celular a cada uno de los seis tubos. Centrifugar estos tubos a 370 veces g durante siete minutos a 10 grados Centígrados y retirar el sobrenadante.

Luego, etiquete seis nuevos tubos FACS como uno a seis y pipetee 200 microlitros de HBSS 2% FCS en cada uno. Preparar las seis mezclas de anticuerpos nuevos añadiendo la cantidad adecuada de anticuerpos a cada tubo de acuerdo con la tabla uno. Mezclar uno es para células no manchadas sin adición de anticuerpos. Las mezclas de dos a cinco contienen un anticuerpo único diferente para los ajustes de compensación. Mix six contiene los cuatro anticuerpos para las células multi-teñidas que se utilizarán para la clasificación.

A continuación, transfiera estas mezclas de anticuerpos a los tubos FACS numerados correspondientes. Incubar estas soluciones durante 20 minutos a cuatro grados centígrados o sobre hielo en la oscuridad. A continuación, agregue un mililitro de HBSS 2% FCS a cada tubo y luego centrifugar de nuevo. Deseche el sobrenadante y luego resuspenda los pellets en 200 microlitros de HBSS 2% FCS. Finalmente, transfiera los pellets resuspendidos a los nuevos tubos FACS etiquetados.

Para realizar FACS, primero encienda el clasificador. A continuación, seleccione el menú del citómetro y haga clic en inicio de fluidos. Siga las instrucciones que aparecen en pantalla.

En la pestaña stream, haga clic en la cruz roja para activar la secuencia y, a continuación, espere 15 minutos para que la secuencia se estabilice. Ajuste la amplitud de la secuencia hasta que vea que aparece una caída separada clara en la pestaña de la secuencia. A continuación, haga clic en punto dulce para completar el ajuste de amplitud. Inserte el filtro Densidad neutra, o ND, 1.0 delante del láser.

Abra el menú del citómetro en la parte superior de la pantalla y seleccione CST, que significa Cytometer Setup and Tracking. Para realizar un control de calidad diario, primero diluir las perlas CST con medio FACS en un tubo FACS siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, cargue el tubo en la máquina y realice el control CST haciendo clic en Ejecutar en la pestaña CST.

Cuando se complete el control CST, reemplace el filtro ND 1.0 por el filtro ND 2.0 en el catómetro. A continuación, diluir las perlas de retardo de gota en el medio FACS siguiendo las instrucciones del fabricante y luego cargar el tubo en el FACS. Para garantizar una clasificación adecuada, realice el retardo de caída haciendo clic primero en el voltaje y luego en el filtro óptico. El cuadrante derecho del filtro óptico debe ser igual al 100%, lo que indica que el 100% de las gotas están registradas por la máquina. Si es necesario, ajuste el tornillo láser rojo en el citómetro izquierdo o derecho para obtener el 100% en el cuadrante derecho. Es importante asegurarse de que la corriente cae en el tubo de recogida. Para ello, realice una clasificación de prueba haciendo clic en el cajón de residuos y, a continuación, pruebe la ordenación. Compruebe que las corrientes laterales caigan en los tubos de recogida. Si no lo hacen, ajuste la tensión debajo de la pestaña de clasificación hasta que lo hagan.

Vaya a la plantilla experimental seleccionando la pestaña del explorador y haciendo clic en Vista compartida. A continuación, abra el experimento Accudrop_DROP DELAY y haga clic en el botón de diseño de ordenación. Ahora, cambie la velocidad de umbral en el panel de adquisición manipulando el caudal hasta que alcance los 3.000 eventos por segundo. Haga clic en voltaje y, a continuación, haga clic en filtro óptico. El cuadrante izquierdo debe ser igual a cero y el cuadrante derecho igual a 100.

Por último, en la ventana de diseño de ordenación, haga clic en ordenar y, a continuación, haga clic en cancelar. El cuadrante izquierdo debe ser igual a 100 y el cuadrante derecho igual a cero. Si el cuadrante izquierdo es menor que 95, haga clic en retardo automático para indicar al software que aumente automáticamente el voltaje para obtener el 100% de las caídas en el cuadrante izquierdo.

Para comenzar la citometría de flujo, primero usaremos células no manchadas para definir la morfología celular y los picos negativos de los fluorocromos. Para ello, coloque el tubo uno que contenga celdas no retenidas en la máquina y, debajo de la pestaña del panel de adquisición, haga clic en cargar. En la pestaña del citómetro, ajuste los voltajes de dispersión hacia adelante y hacia los lados hasta que vea su población celular como una densa concentración de puntos en la pantalla. Los linfocitos son células pequeñas, por lo que tendrán una dispersión hacia adelante baja y dispersión lateral baja.

A continuación, elimine la fluorescencia de fondo ajustando el voltaje de los fluorocromos en la pestaña del citómetro hasta que las poblaciones celulares a un nivel negativo estén en la primera década en la pestaña de la hoja de trabajo global. En el menú del citómetro, haga clic en la configuración de la vista y verifique que todos los fluorocromos estén presentes. A continuación, coloque el tubo dos en el citómetro y haga clic en cargar. Ajuste la superposición espectral en la pestaña del citómetro hasta que las medianas de población negativas y positivas estén alineadas en la pestaña de la hoja de cálculo global. En la pestaña adquisición, establezca los eventos para registrar el parámetro en 10.000 y haga clic en registro. Repita estos pasos con los tubos tres, cuatro y cinco.

A continuación, cargue el tubo seis que contiene las células de varios manchas. Para aislar los linfocitos B, primero configure los parámetros para ordenar las células en función de su morfología. En la primera ventana, trace el área de dispersión hacia adelante FSC-A en el eje Y y el área de dispersión del lado SSC-A en el eje X. En el gráfico de dispersión, cada punto representa una celda. Haga clic en la puerta poligonal en la hoja de trabajo global y luego seleccione la población con una dispersión hacia adelante baja y una dispersión lateral intermedia. En una nueva ventana de trazado de puntos, haga clic con el botón derecho en la ventana y seleccione Mostrar poblaciones en el menú y haga clic en P1.

Luego, en la nueva ventana, agarre las celdas positivas viables CD45 trazando la viabilidad en el eje Y y CD45 en el eje X. Utilice la puerta poligonal para rodear las celdas con una baja viabilidad y una señal CD45 alta y seleccione P2 para mostrar las celdas seleccionadas en una nueva ventana. En la siguiente ventana, puerta para leucocitos positivos CD45, excluyendo linfocitos T. Con CD45 en el eje X y CD3 en el eje Y, circule a la población con una señal CD45 alta y una señal CD3 negativa baja y seleccione P3. Por último, puerta para células positivas CD19 que identifican los linfocitos B. Con CD19 en el eje Y y CD3 en el eje X, circule a la población con una señal CD19 alta y una señal CD3 negativa baja y seleccione P4.

Ahora se establecen todos los parámetros de ordenación. A continuación, en la ventana de diseño de clasificación, seleccione su población celular de interés- P4, que es la cuarta población que estaba cerrada, y le dice a la máquina que ordene sólo los linfocitos B. Establezca los eventos de destino en 10.000 celdas y establezca la precisión en pureza. Sólo estamos clasificando una población. Sin embargo, se pueden clasificar hasta cuatro poblaciones diferentes al mismo tiempo. Una vez listo, haga clic en ordenar y Aceptar. Luego, espere a la clasificación celular.

Una vez completada la clasificación celular, realice un control de pureza pipeteando 10 microlitros de las células clasificadas en un nuevo tubo FACS con 90 microlitros de HBSS 2% FCS. Coloque el tubo en el citómetro, haga clic en cargar y luego haga clic en registro para analizar los fenotipos de las celdas para verificar que la estrategia de gating funcionó según lo previsto.

Ahora, analizaremos las células ordenadas para determinar el porcentaje de linfocitos B entre los leucocitos que fueron aislados del bazo del ratón. Para empezar, haga doble clic en el icono FlowJo y arrastre los archivos de cada tubo a la ventana de muestra.

Haga clic en polígono y vuelva a crear las estrategias de gating que se utilizaron en la sección anterior. A continuación, haga clic en el editor de diseño y arrastre las poblaciones de linfocitos B de interés desde el tubo seis y el control de pureza a la pestaña del editor de diseño. En este ejemplo, la gráfica en la parte superior derecha representa los linfocitos B ordenados de la suspensión total de la célula del bazo y la gráfica en la parte inferior derecha es el control de pureza. Las células sólo deben aparecer en la población de interés en el control de pureza.

Para comprobar la pureza de los linfocitos B en las células ordenadas, haga clic en el editor de tablas. Arrastre la población de linfocitos B del tubo seis y el control de pureza en la tabla. En el menú estadístico, seleccione la frecuencia de las células positivas CD45 para probar la pureza de esta población celular. A continuación, haga clic en crear tabla. Los valores de parámetro aparecen en una nueva tabla. En la ventana de control de pureza, compruebe la frecuencia de los linfocitos B dentro de las células positivas CD45, que debe ser superior al 98%.

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