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養子細胞移植:宿主マウスへのドナーマウス脾細胞導入とFACSによる成功評価

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養子細胞移植は、目的の細胞を生物に導入する方法である。これは、免疫細胞の特定のクラスの作用を含む様々な生物学的メカニズムを研究するための強力な技術です。さらに、養子移植は、患者自身のT細胞を抽出し、癌細胞を認識して破壊するために変更することができる骨髄移植や癌治療を必要とするものなど、多くの条件のための有望な新規治療であり、その後、腫瘍と戦うために体に戻りました。

実験室では、動物モデルは、多くの場合、養子移植を研究するために使用されます。例えば、CD45.1ラグガンマ-cノックアウトマウスは、造血幹細胞をリンパ球に正常に分化するために不可欠な多くのサイトカインの基本的な受容体を欠いている。その結果、ノックアウトマウスは、リンパ球の発達が損なわれ、ナチュラルキラー、またはNK、細胞、T細胞、またはB細胞を有しない。

養子移植は、これらの侵害されたマウスに欠損した免疫細胞を導入するために使用することができ、まず脾臓などの高濃度の免疫細胞を含むドナーマウス組織を採取する。その後、組織は解離され、免疫細胞を含む様々な脾臓細胞が単離される。次に、不要な赤血球、または赤血球は、塩化カリウムのライシングバッファーと残りの白血球、または脾細胞の添加を介して、遠心分離を使用して細胞破片から分離することによってlysを行うことができる。

最後に、精製された脾細胞を免疫不全マウスに注入し、これらの細胞の機能の詳細な研究を容易にする。数日後、養子免疫細胞移植の成功は、ドナー組織と同様に宿主脾臓を最初に分離および準備することによって確認することができる。次いで、これらの細胞は、ドナー免疫細胞マーカーに対して標識抗体を用いて染色され、FACSを用いて検証およびソートすることができる。

まず、実験室用手袋と適切な保護具を着用してください。次に、鉗子を洗い、洗剤でハサミを解剖し、次に70%のエタノールで洗い流し、清潔なペーパータオルで乾かします。ハンクのバランス塩溶液(HBSS)の50ミリリットルを2%の胎児子牛血清、またはFCSで50ミリリットルのチューブに49ミリリットルのHBSSと組み合わせることによって準備します。溶液を約10回上下にゆっくりとピペッティングして混ぜます。

安楽死マウスを解剖し、脾臓Bリンパ球分離のためのJoVEビデオプロトコルFACS技術で示されているように脾臓を除去する。免疫細胞を分離するには、まず脾臓を40マイクロメートルのセルストレーナーにペトリ皿に置きます。脾臓をプランジャーでつぶし、皿に切り離します。HBSS 2%FCSの1ミリリットルでプランジャーとストレーナーをすすいで付着した細胞を回収します。次に、ペトリ皿から50ミリリットルの遠心管に解離された脾臓と流体をピペットする。5ミリリットルのHBSS 2%FCSでペトリ皿を洗い、15ミリリットルのチューブに流体を移します。

10°Cで7分間370回gでチューブを遠心分離し、ペレットを邪魔しないように慎重にチューブを取り出します。次に、ペレットを乱さずに上清を取り出し、適切な廃棄物容器に液体を捨てます。次に、遠心管に塩化カリウム分解能の2ミリリットルを加え、ペレットを再中断し、赤血球を分解するために上下にピペットを追加します。2 分間待ってから、HBSS 2% FCS を再懸濁ペレットに追加し、合計値 14 ミリリットルを取得します。遠心分離を繰り返します。慎重にチューブを取得し、上清を廃棄します。次いで、上下にピペッティングして5ミリリットルHBSS 2%FCSでペレットを再中断する。次に、懸濁液中のセルをカウントします。5マイクロリットルのトリパンブルーを5マイクロリットルのセルサスペンションに加え、ピペッティングでよく混ぜます。次に、カバーガラスとマラセススライドの間に5マイクロリットルの希釈セル懸濁液を静かに堆積させます。顕微鏡を40倍の倍率に設定し、細胞数をカウントします。HBSS 2% FCSの適切な体積を加えることによって、1ミリリットル当たり7セルに細胞濃度を10に調整します。

養子転写を開始するには、細胞懸濁液の2ミリリットルを5ミリリットルの回収管に移す。10°Cで7分間370回gでチューブを遠心分離し、上清を捨てます。次に、ペレットを2ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水で再中断し、チューブを10°Cで7分間370回gで遠心分離する。上清を捨てます。次いで、リン酸緩衝生理食塩水の200マイクロリットルでペレットを再中断する。29ゲージの針を持つ0.5ミリリットルの注射器を使用して、200マイクロリットルの細胞懸濁液を実験マウスに静脈内に静脈内に注入する。

養子移植の4日後に、マウスを安楽死させ、脾臓を取り除く。次いで、セクション3に記載されている免疫細胞を収穫する。次に、各マウスから100マイクロリットルの細胞懸濁液を、標識された2本のFACSチューブに転送し、制御して転送する。10°Cで7分間370回gでチューブを遠心分離し、上清を捨てます。さて、表1に記載されている希釈で4つの抗体を含む混合物を調記する。各チューブにミックスの100マイクロリットルを追加し、暗闇の中で氷の上に20分間インキュベートします。次に、各チューブにHBSS 2%FCSの1ミリリットルを追加し、10°Cで3分間370回gでチューブを遠心分離します。上清を廃棄し、HBSS 2%FCSの200マイクロリットルでペレットを再懸濁します。再懸濁したセルを新しい標識FACSチューブに移します。ここで、FACS プロトコルに示すようにフローサイトメトリーを使用して、CD45 の存在を評価します。2陽性リンパ球。

次に、CD45から単離したCD45.2リンパ球の存在を判定する。1宿主脾臓。開始するには、FlowJo アイコンをダブルクリックし、すべてのサンプル ウィンドウで各チューブのファイルをドラッグします。次に、転送されたファイルをダブルクリックして、そのサンプルから記録されたセルをドット プロットに表示し、X 軸に前方散布 FSCA を表示し、Y 軸上に SSCA を横散乱します。ポリゴンをクリックしてリンパ球集団を円で囲みます。新しいサブ人口識別ウィンドウが表示されます。[OK] をクリックします。次に、Y 軸を FSC-W に、X 軸を FSC-A に設定します。前に示したように、ポリゴン ツールを使用して単一セルの作成を選択します。

次に、円で囲まれた人口をダブルクリックして、選択したセルの新しいウィンドウを作成します。新しいウィンドウで、YのCD45.2を選択し、XのCD45.1を選択し、Tアイコンをクリックし、軸をカスタマイズしてプロットを拡大します。次に、ポリゴンをクリックして CD45.2 陽性セルを丸で囲みます。サブ人口識別ウィンドウで、セル母集団に転送されたセルに名前を付け、[OK] をクリックします。同じウィンドウで、四角形をクリックして CD45.2 負のセルを選択します。サブ人口識別ウィンドウで、セル母集団ホストセルに名前を付け、[OK] をクリックします。次に、CD45.2 円で囲まれた母集団をダブルクリックして、選択したセルの新しいウィンドウを作成します。新しいウィンドウで、Y の CD3 と X の CD4 を選択します。

次に、ポリゴンをクリックして CD4 CD3 陽性セルを丸で囲みます。このサブ人口識別ウィンドウで、セル母集団が転送された CD4 セルに名前を付けます。次に、コントロール マウス ファイルで前の解析手順を繰り返します。最後に、セルの母集団を視覚化するには、[レイアウト エディタ] をクリックします。転送されたセルと転送された CD4 セルの作成を、転送されたファイルから[レイアウト エディタ]タブにドラッグしてコントロールファイルにドラッグします。CD45.2陽性細胞とCD4リンパ球を表すドットプロットが現れる。CD452 つの転送されたセルは、転送されたマウス ドット プロットにのみ表示されます。

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