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Serielle Verdünnungen und Beschichtung
 

Serielle Verdünnungen und Beschichtung: Mikrobielle Aufzählung

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Manchmal müssen wir, um Bakterien zu identifizieren und zu untersuchen, sie zunächst isolieren und aus einer Probe anreichern. Zum Beispiel werden Proben aus einer Winogradsky-Säule gemischt, was bedeutet, dass sie mehrere Arten oder Bakterienstämme enthalten, so dass die Untersuchung eines einzelnen Bakteriums oder die Aufzählung der verschiedenen vorhandenen Arten eine Herausforderung darstellen kann. Zu diesem Zweck werden in der Regel serielle Verdünnungs- und Beschichtungstechniken eingesetzt, um die bakterielle Belastung zuverlässig zu quantifizieren und einzelne Kolonien zu isolieren.

Die serielle Verdünnung ist ein Prozess, durch den die Konzentration eines Organismus, Bakterien in diesem Beispiel, systematisch durch sukzessive Resuspension in festen Mengen flüssiger Verdünnungsmittel reduziert wird. Normalerweise ist das Volumen des Verdünnungsmittels ein Vielfaches von 10, um die logarithmische Reduktion des Probenorganismus zu erleichtern. Zum Beispiel wird zunächst ein Gramm Sediment aus der Winogradsky-Zone entfernt und 10 Milliliter eines geeigneten flüssigen Mediums zugegeben. Dann wird einem anderen Rohr, das neun Milliliter Medium enthält, ein Milliliter dieser ersten Verdünnung zugesetzt. Der Prozess kann wiederholt werden, bis mehrere verschiedene Konzentrationen von Bakterien vorbereitet wurden. Serielle Verdünnung ist der Schlüssel zur Aufzählung von Bakterien in diesem Beispiel, da gemischte Proben aus einer Winogradsky-Säule eine unbekannte, oft große Anzahl von Bakterien enthalten.

Als nächstes ermöglichen die Streifenbeschichtung und die Streubeschichtung die Isolierung und Aufzählung von Bakterien innerhalb einer Probe. Streaking wird durch die Einführung einer verdünnten Probe in einen Abschnitt des festen Mediums mit Nährstoff entemiert erreicht, der in Drittel unterteilt ist. Dieses Inokulum wird dann in einem Zick-Zack-Muster über jedes Drittel der Platte verteilt. Da verschiedene Teile der Platte gestreift sind und sich nur einmal von der vorherigen Probe kreuzen, wird die Probe dünner verteilt. Dies bedeutet, dass Sie möglicherweise nur von einer Verdünnung streifen müssen, um einzelne Kolonien in den späteren Abschnitten zu erreichen. Nach der Inkubation ermöglichen die gestreiften Platten Beobachtungen der Koloniemorphologie, Informationen, die helfen können, zwischen verschiedenen Bakterienarten zu unterscheiden.

Alternativ kann, wenn das Hauptziel ist, die Aufzählung der Bakterien in der Probenausbreitung Beschichtung verwendet werden. Bei der Streubeschichtung wird ein Aliquot einer einzelnen Probe gleichmäßig über die gesamte Oberfläche des festen Mediums verteilt. In der Regel, weil wir die Bakterienzahlen in der gemischten Probe nicht kennen, wird für jede der Verdünnungen oder eine repräsentative Probe von ihnen eine Streuplatte hergestellt. Nach der Inkubation kann die Aufzählung mit diesen Streuplatten durchgeführt werden. Alle Platten mit Koloniezahlen von weniger als 30 sollten verworfen werden, da kleine Zahlen größeren Fehlern unterliegen. Ebenso sollten alle Überzahlwerte über 300 verworfen werden, da das Übervervölkern und Überlappen von Kolonien zu einer Unterschätzung der Kolonieanzahl führen kann. Wenn die Koloniezahlen jedes dieser verbleibenden Schalen aufgezeichnet und mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert und dann durch das plattierte Volumen dividiert werden, ergibt dies die Kolonie bildenden Einheiten, oder KBE, pro Milliliter Suspension. In diesem Video erfahren Sie, wie Sie eine Probe, die ein bekanntes Bakterium enthält, und die mikrobiellen Gemeinschaften, die in verschiedenen Regionen einer Winogradsky-Säule enthalten sind, durch serielle Verdünnung, Streuung und Streifenbeschichtung qualitativ und quantitativ bewerten.

Ziehen Sie zunächst alle geeigneten persönlichen Schutzausrüstungen an, einschließlich Labormantel, Handschuhe und Schutzbrille. Als nächstes sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol und wischen Sie die Oberfläche ab. Als nächstes zwei 500-Milliliter-Erlenmeyer-Flaschen sammeln und eine Brühe und den anderen Agar beschriften. Zur Zubereitung der LB-Agar-Lösung etwa 6,25 Gramm LB-Agar, drei Gramm technischea gar und 250 Milliliter destilliertes Wasser in den Kolben mit der Bezeichnung Agar mischen.

Dann bereiten LB Brühe durch Kombination 2. 5 Gramm LB-Medien und 100 Milliliter destilliertes Wasser in der Mitbrühe. Nach dem Autoklavieren der Kolben, verwenden Sie einen hitzebeständigen Handschuh, um die Kolben aus dem Autoklaven zu entfernen und legen Sie sie in einem 40 bis 50 Grad Celsius Wasserbad. Sobald die Kolben 50 Grad Celsius sind, sorgfältig vorbereiten drei 100 Milliliter Aliquots der Brühe Lösung und beschriften jede Aliquot-Lösung Null. Als nächstes sammeln Sie 10 sterile Petrischalen und kennzeichnen sie mit dem Datum, dem Namen, der Art der verwendeten Medien und der Winogradsky-Säulenzone, aus der die Organismen geerntet werden. 15 Milliliter Agar aus dem Agarkolben in jede Petrischale pfeifen. Dann verwenden Sie die Pipettenspitze, um Blasen zu entfernen, ersetzen Sie die Plattendeckel, und lassen Sie sie auf der Bank oben über Nacht zu erstarren.

Am nächsten Tag die Bank mit 70% Ethanol abwischen. Als nächstes 10 20 Milliliter Reagenzgläser T1 bis T10 beschriften und in ein Rack legen. Pipette neun Milliliter von .45% Saline in jedes Rohr. Bedecken Sie nun jedes der 10 Reagenzgläser locker mit ihren Kappen und übertragen Sie sie in ein autoklavkompatibles Reagenzglasregal. Nachdem der Zyklus abgeschlossen ist, entfernen Sie die Saline-Rohlinge mit hitzebeständigen Handschuhen und lassen Sie sie abkühlen. Bewahren Sie die Rohre bei Raumtemperatur auf, bis sie etwa 22 Grad Celsius erreicht haben.

Um einen bekannten Zielorganismus, E. coli, in diesem Beispiel zu kultivieren, impfen 100 Milliliter Lösung Null mit einer einzigen Kolonie aus einer zuvor gestreiften Platte. Dann bedecken Sie die Röhre und bebrüten sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Um die Bereiche einer Winogradsky-Säule auszuwerten, fügen Sie etwa ein Gramm Material aus der Aerobic-Zone zu T1 hinzu und setzen Sie sich durch Wirbel wieder aus. Wiederholen Sie diesen Vorgang dann mit einem Gramm Material aus der anaeroben Zone.

Entfernen Sie die mit E. coli geimpfte Lösung Null aus dem Inkubator und schütteln Sie sie. Dann pipette einen Milliliter der Lösung in ein T1-Reagenzglas und Wirbel zu mischen. Entfernen Sie einen Milliliter Lösung aus T1 und übertragen Sie es auf T2, Wirbel zu mischen. Wiederholen Sie diesen Vorgang durch Rohr T10. Um die aeroben und anaeroben Zonen der Winogradsky-Säule zu bewerten, entfernen Sie einen Milliliter Lösung aus jedem der zuvor vorbereiteten T1-Rohre und übertragen Sie ihn in die entsprechenden T2-Rohre. Fahren Sie dann die seriellen Verdünnungen durch die T10-Rohre fort, wie zuvor gezeigt.

Um Platte zu verteilen, Pipette 100 Mikroliter der verdünnten Probe von jedem T3-Rohr auf die entsprechende Petrischale. Verwenden Sie dann eine sterile Streustange, um die Probe vorsichtig auf die Petrischale zu verteilen und den Plattendeckel zu ersetzen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Verdünnungen T6 und T9, wie zuvor gezeigt. Inkubieren Sie die Platten, die aerobe Organismen in einem 37 Grad Celsius Inkubator für 24 Stunden enthalten. Inkubieren Sie die Platten mit anaeroben Organismen in einer anaeroben Kammer, die 24 Stunden lang auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Am nächsten Tag entfernen Sie die Verdünnungsplatten T3, T6 und T9 aus dem Inkubator und der anaeroben Kammer und übertragen Sie sie auf die Bankspitze. Wenn Sie mit einer Platte nach der anderen arbeiten, gleiten Sie eine sterile Impfschleife in einem Zick-Zack-Muster über die Oberseite der Medien. Dann ersetzen Sie den Petrischalendeckel. Als nächstes drehen Sie die Platte um 1/3 und sterilisieren die Schleife, um die Frequenz des zuvor hergestellten Zick-Zack-Musters zu reduzieren. Wiederum, nach der Sterilisation der Schleife, drehen Sie die Platte um 1/3, reduzieren Sie die Frequenz des Zick-Zack-Musters ein letztes Mal, und ersetzen Sie den Deckel. Wiederholen Sie diese Streaking-Methode für die verbleibenden Platten, wie zuvor gezeigt. Dann legen Sie die gestreiften Platten mit aeroben Organismen über Nacht in einen 37 Grad Celsius Inkubator und die gestreiften Platten mit anaeroben Organismen in einer anaeroben Kammer, die über Nacht auf 37 Grad Celsius eingestellt ist.

Kulturen wurden aus den aeroben und anaeroben Zonen einer siebentägigen Winogradsky-Säule geerntet. Dann wurden die Kulturen seriell verdünnt, bevor sie auf LB-Agarplatten streiften und sich ausbreiteten. Streaking ergab eine gemischte Population aus jeder der bewerteten Winogradsky-Zonen, und die Streuplatten lieferten ähnliche Ergebnisse. Eine Platte, die aus einer gemischten Population gestreift ist, führt zu Bakterienkolonien in verschiedenen Formen, Größen, Texturen und Farben. Im Gegensatz dazu zeigten die gestreiften und ausgebreiteten Platten, die den bekannten Organismus E. colienthielten, eine homologe Population. Im Allgemeinen ist es am besten, KBE pro Milliliter unter Verwendung der durchschnittlichen Koloniezahl von drei Platten zu berechnen, die mit der gleichen Probe und dem gleichen Verdünnungsfaktor verteilt sind. Multiplizieren Sie die durchschnittliche Anzahl der Kolonien mit dem Verdünnungsfaktor und dividieren Sie durch den Betrag aliquoted. Schließlich können isolierte Kolonien, die aus jeder Platte ausgewählt wurden, in weiteren Anreicherungstests verwendet werden, um die Artenidentität zu bestimmen.

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