Overview
Fonte: Tilde Andersson1, Rolf Lood1
1 Dipartimento di Scienze Cliniche Lund, Divisione di Medicina delle Infezioni, Centro Biomedico, Università di Lund, 221 00 Lund, Svezia
Apparentemente impossibile da determinare, la biodiversità microbica è davvero sbalorditiva con una stima di un trilione di specie coesiste (1,2). Sebbene climi particolarmente rigidi, come l'ambiente acido dello stomaco umano (3) o i laghi subglaciali dell'Antartide (4), possano essere dominati da una specie specifica, i batteri si trovano tipicamente nelle colture miste. Poiché ogni ceppo può influenzare la crescita di un altro (5), la capacità di separare e coltivare colonie "pure" (costituite da un solo tipo) è diventata essenziale sia in ambito clinico che accademico. Le colture pure consentono ulteriori esami genetici (6) e proteomici (7), l'analisi della purezza del campione e, forse più degno di nota, l'identificazione e la caratterizzazione di agenti infettivi da campioni clinici.
I batteri hanno una vasta gamma di requisiti di crescita e ci sono numerosi tipi di mezzi nutritivi progettati per sostenere sia le specie poco esigenti che le specie esigenti (8). I mezzi di crescita possono essere preparati sia in forma liquida (come brodo) che in una forma solida tipicamente a base di agar (un agente gelificante derivato dalle alghe rosse). Mentre l'inoculazione diretta in brodo comporta il rischio di generare una popolazione batterica geneticamente diversificata o addirittura mista, la placcatura e la ri-striatura creano una coltura più pura in cui ogni cellula ha un corredo genetico molto simile. La tecnica della piastra striata si basa sulla progressiva diluizione di un campione (Figura 1), con l'obiettivo di separare le singole cellule l'una dall'altra. Qualsiasi cellula vitale (di seguito denominata unità formante colonia, CFU) sostenuta dal mezzo e dall'ambiente designato può successivamente trovare una colonia isolata di cellule figlie attraverso la fissione binaria. Nonostante i rapidi tassi di mutazione all'interno delle comunità batteriche, questo gruppo di cellule è generalmente considerato clonale. La raccolta e la ri-striatura di questa popolazione assicura di conseguenza che il lavoro successivo coinvolga solo un singolo tipo batterico.
Figura 1: Una piastra striata si basa sulla diluizione progressiva del campione originale. I) L'inoculo viene inizialmente disperso utilizzando un movimento a zig-zag, creando un'area con una popolazione batterica relativamente densa. II-IV) Le strisce vengono disegnate dall'area precedente, utilizzando ogni volta un ciclo di inoculazione sterile, fino a raggiungere il quarto quadrante. V) Un movimento finale a zig-zag diretto verso il centro della placca forma una regione in cui l'inoculo è stato marcatamente diluito, permettendo alle colonie di apparire separate l'una dall'altra.
La tecnica della piastra striata può anche essere combinata con l'uso di mezzi selettivi e/o differenziali. Un mezzo selettivo inibisce la crescita di alcuni organismi(ad esempio attraverso l'aggiunta di antibiotici) mentre un mezzo differenziale aiuterà esclusivamente a distinguere l'uno dall'altro(ad esempio attraverso l'emolisi su piastre di agar nel sangue).
Alla base di tutto il lavoro in microbiologia c'è l'uso di tecniche asettiche (sterili). Ogni coltura batterica deve essere considerata potenzialmente patogena in quanto vi è il rischio di crescita involontaria di ceppi insidiosi, formazione di aerosol e contaminazione di attrezzature/personale. Per ridurre al minimo questi rischi, tutti i supporti, gli articoli in plastica, metallo e vetro vengono in genere sterilizzati attraverso l'autoclave prima e dopo l'uso, sottoponendoli a vapore saturo ad alta pressione a circa 121 ° C che elimina efficacemente le cellule persistenti. Lo spazio di lavoro viene generalmente disinfettato utilizzando etanolo sia prima che dopo l'uso. Il cappotto da laboratorio e i guanti sono sempre indossati durante il lavoro con agenti infettivi.
Procedure
1. Configurazione
- Tutti i microbi dovrebbero essere trattati come se fossero pericolosi. Indossare sempre un cappotto da laboratorio e guanti, legare i capelli lunghi e assicurarsi che eventuali ferite siano particolarmente ben protette.
- Preparare lo spazio di lavoro sterilizzandolo utilizzando il 70% di etanolo.
- Assicurarsi che le piastre di agar, le soluzioni campione e una scatola di anelli di inoculazione in plastica pre-sterilizzati o un anello metallico più una fiamma Bunsen siano a portata di mano. I loop di plastica usa e getta sono in genere pre-sterilizzati. I loop metallici devono essere immersi nel 70% di etanolo, quindi tenuti vicino all'area blu di una fiamma Bunsen e riscaldati fino a quando non sono caldi. Lasciare raffreddare il filo sollevando il coperchio della piastra (solo leggermente per evitare contaminazioni) e picchiettandolo contro il mezzo solidificato.
- Completare ogni procedura con una sterilizzazione ripetuta dello spazio di lavoro e un accurato lavaggio/sterilizzazione di mani e polsi.
2. Protocollo
- Preparazione dei media
- Identificare e preparare un mezzo solido (in genere contenente l'1,5% (p / v) di agar) che sosterrà la specie / ceppo batterico utilizzato. Mescolare il mezzo in una bottiglia in grado di contenere il doppio del volume finale per evitare il trabocco in autoclave.
- Sterilizzare il materiale ponendo il biberon, con tappo semisertato, in autoclave impostata a 121°C per 20 min.
- Chiudere correttamente il tappo non appena il flacone viene rimosso dall'autoclave. Se il supporto deve essere utilizzato a breve, posizionare la bottiglia in un bagno d'acqua impostato a 45 ° C per conservarlo allo stato liquido. L'agar altrimenti si solidificherà a meno di 32-40 ° C e può essere successivamente riscaldato (in genere utilizzando un forno a microonde) in un punto di fusione a 85 ° C.
- Preparazione della/e piastra/e di coltura
- Contrassegnare la base delle piastre di Petri sterili (in genere 100 x 15 mm) sul lato o sul fondo con il nome dello sperimentatore, la data e il tipo di supporto.
- Versare 20-25 mL di terreno di coltura agar a 45°C (precedentemente preparato) in ciascuna delle piastre etichettate. Se la schiuma appare lungo i bordi, questa dovrebbe essere rapidamente rimossa usando una pipetta normale e una punta sterile.
- Rimettere immediatamente tutti i coperchi sui piatti per evitare contaminazioni.
- Lasciare solidificare l'agar per circa 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4°C. Una volta impostate, le piastre di coltura batterica devono essere successivamente conservate capovolte a 4 ° C per ridurre al minimo la condensa sulla superficie del mezzo.
- Placcatura a striature
- Immergere un anello sterile nell'inoculo desiderato e disperdere immediatamente il campione raccolto sul primo quadrante della piastra usando un movimento a zig-zag (Figura 1, I).
- Chiudere il coperchio e risterizzare l'anello di inoculazione o raccogliere un nuovo anello sterile monouso.
- Effettuare 3-4 colpi irradiando dal primo quadrante (contenente una popolazione batterica relativamente densa) verso il secondo quadrante della piastra (Figura 1, II).
- Chiudere il coperchio e risterizzare il ciclo di inoculazione o scartare il ciclo usa e getta e raccoglierne uno nuovo sterile.
- Ripeti questa striscia di 3-4 colpi dal secondo al terzo quadrante, e poi dal terzo al quarto quadrante, usando ogni volta un ciclo sterile (Figura 1, III - IV).
- Usando un loop sterile, fai un tratto finale in uno schema a zig-zag dal quarto quadrante verso il centro della piastra (Figura 1, V). La prevalenza batterica sarà inferiore in quest'area, consentendo idealmente di stabilire singole colonie da una singola cellula madre vitale.
- Chiudere il coperchio e (se richiesto dalle specie batteriche) sigillare con parafilm per impedire il flusso d'aria.
- A seconda della specie/ceppo batterico, posizionare la piastra di coltura verso l'alto in un ambiente adatto e incubare fino a quando le colonie batteriche sono visibili (colonie segregate possono apparire in entrambe le aree della piastra poiché la concentrazione iniziale può variare).
- Per generare una popolazione batterica clonale, strisciare un'altra piastra, scambiando l'inoculo placcato sulla piastra originale con cellule isolate da una singola colonia della piastra originale.
Su una capsula di Petri, se un singolo batterio subisce più cicli di riproduzione asessuata, porterà alla formazione di una colonia clonale. Tuttavia, ottenere un singolo batterio da un campione misto, come una sospensione del suolo, può essere difficile. Se si esegue un ciclo di questa cultura eterogenea, può contenere fino a un trilione di singoli batteri. Per diffondere così tanti batteri sulla superficie di una piastra di agar e ottenere una singola colonia, anche usando un modello a zig-zag, il loop dovrebbe essere trascinato continuamente sulla superficie di un numero sufficiente di piastre affiancate per circondare l'intera Liberty Island. Ovviamente, gli scienziati non usano davvero così tanti piatti. Invece, usano una tecnica chiamata streak plating.
La tecnica della piastra striata si basa sulla progressiva diluizione di un campione batterico e viene eseguita sulla superficie solida di una singola capsula di Petri. Per iniziare, la superficie del supporto è visivamente divisa in cinque sezioni assegnando quattro frammenti della circonferenza come le prime quattro sezioni e il centro della piastra come quinta. Ciò creerà effettivamente cinque piastre multimediali da una singola capsula di Petri. Successivamente, utilizzando un ciclo di inoculo desiderato, la prima sezione viene striata utilizzando un motivo a zig-zag. Quindi, viene utilizzato un nuovo anello usa e getta o, nel caso di un anello di filo, viene sterilizzato con un bruciatore Bunsen, infiammandolo fino a quando non è rovente lungo la lunghezza del filo. Questo uso di un nuovo loop, o flame sterilize loop, rimuove tutte le cellule batteriche rimanenti, aiutando nella diluizione dei batteri. L'hot loop viene quindi raffreddato nell'aria per alcuni secondi prima di essere trascinato attraverso la prima sezione per creare tre o quattro linee separate, ognuna delle quali trasporta solo una frazione di batteri nella seconda sezione. Le sezioni rimanenti sono striate allo stesso modo, usando ogni volta un anello sterile e un singolo passaggio attraverso la striscia precedente.
Utilizzando questo ciclo di striature e sterilizzazione, la concentrazione batterica in ogni sezione successiva deve essere diluita in modo che la sezione finale contenga solo pochi batteri discretamente localizzati. Al momento dell'incubazione, questi batteri discreti si moltiplicano per produrre colonie clonali isolate di cellule figlie, che sono indicate come unità formanti colonie o CFU. Questi possono essere raccolti e ri-striati per garantire che il lavoro successivo coinvolga solo un singolo tipo batterico, indicato come una coltura pura. Oltre a isolare singole colonie da una coltura batterica mista, la tecnica di placcatura a strisce viene utilizzata anche per selezionare ceppi specifici del mezzo, determinare la morfologia delle colonie batteriche o identificare diverse specie batteriche. In questo video, dimostreremo come isolare le colonie monobatte batteriche da una sospensione di campioni batterici misti tramite tecnica di placcatura a strisce.
Per iniziare, indossa guanti da laboratorio e un cappotto da laboratorio. Quindi, sterilizzare lo spazio di lavoro utilizzando il 70% di etanolo. Quindi, selezionare un mezzo adatto che sostenga la specie o il ceppo batterico utilizzato e iniziare a preparare il supporto. Qui, l'agar LB comune viene preparato pesando dieci grammi di mezzi in polvere pre-formulati e 7,5 grammi di agar. Aggiungere i componenti pesati e asciugati a una bottiglia di vetro in grado di contenere il doppio del volume finale per evitare il trabocco. Quindi, aggiungere 500 millilitri di acqua alla bottiglia e tapparla semi-strettamente. Sterilizzare il supporto mettendo la bottiglia in un'autoclave impostata a 121 gradi Celsius per venti minuti. Dopo il completamento, utilizzare guanti resistenti al calore o un cuscinetto caldo per rimuovere il supporto dalla macchina e quindi ruotare immediatamente il tappo della bottiglia per chiuderlo ermeticamente.
Per l'uso in giornata, lasciare raffreddare il supporto mettendo la bottiglia in un bagno d'acqua riscaldato a circa 45 gradi Celsius, per preservare il supporto allo stato liquido. In alternativa, il supporto può essere lasciato a temperatura ambiente per essere riposto allo stato solido. Quando necessario, microonde la bottiglia con il coperchio leggermente aperto per sciogliere il supporto e lasciare raffreddare il supporto utilizzando un bagno d'acqua a 45 gradi Celsius.
Quindi, prendi una manica di piastre di Petri sterili e, con un pennarello permanente, etichettale con i nomi dell'investigatore e dei media, nonché la data. Quindi, trasferire il volume richiesto di supporti in un recipiente sterile e aggiungere antibiotici o altri componenti sensibili, se necessario. Qui, 50 millilitri di media vengono miscelati con 100 microlitri di Kanamicina per una concentrazione finale di 25 microgrammi per millilitro. Ruotare il tubo per garantire una distribuzione uniforme dei componenti aggiunti in tutto il supporto. Lentamente, in modo da evitare la formazione di bolle, versare da 20 a 25 millilitri di terreno di coltura di circa 45 gradi Celsius in ciascuna delle piastre. Se compaiono bolle o schiuma, rimuovere rapidamente utilizzando una pipetta normale e una punta sterile. Quindi, sostituire immediatamente tutti i coperchi per evitare la contaminazione. Lasciare che l'agar si solidifichi a temperatura ambiente per almeno due ore o durante la notte. Una volta solidificate, conservare le piastre di coltura a testa in giù a quattro gradi Celsius per ridurre al minimo la condensa sulla superficie del mezzo.
Per strisciare la cultura di scelta, prima prendi un piatto di coltura pulito e rimuovi il coperchio. Lavorando rapidamente, immergere un anello sterile usa e getta nell'inoculo desiderato e quindi tamponare immediatamente il ciclo sul primo quadrante della piastra con un movimento a zig-zag. Sostituire il coperchio del piatto, scartare il ciclo di inoculazione utilizzato, quindi selezionare un nuovo ciclo sterile. Usando il nuovo loop, fai da tre a quattro tratti attraversando la linea del tampone originale che si irradia dal primo quadrante, che dovrebbe contenere una popolazione di batteri relativamente densa nel secondo quadrante. Chiudere nuovamente il coperchio ed eliminare il cappio. Con un nuovo loop, ripeti di nuovo questa azione, ma questa volta strisciando dal secondo al terzo quadrante. Quindi, con un nuovo loop di nuovo, fai un'altra striscia dalla terza alla quarta sezione della piastra. Infine, con un nuovo loop, fai un ultimo colpo in uno schema a zig-zag dal quarto quadrante verso il centro della piastra. La prevalenza batterica sarà inferiore in quest'area, consentendo idealmente di stabilire singole colonie da una singola cellula madre vitale.
Sostituire il coperchio della piastra e, se appropriato per le specie batteriche, sigillare la piastra con para pellicola per impedire il flusso d'aria. Capovolgere la piastra di coltura per evitare gocciolamenti di condensa, quindi posizionare a una temperatura adeguata per la crescita. Qui, un'incubatrice è impostata su 37 gradi Celsius. Lasciare incubare la piastra fino a quando le colonie batteriche sono visibili. Per generare una popolazione batterica clonale, selezionare una colonia discreta da questa piastra. Ora, con il loop sterile, tocca la colonia bersaglio e, come prima, fai una striscia nel primo quadrante di una nuova piastra. Continuare a sterilizzare alternativamente il loop e strisciare i quadranti rimanenti della piastra come precedentemente dimostrato, terminando con lo zig-zag al centro. Chiudere la piastra e posizionarla per incubare fino a formare colonie discrete. Una volta che queste colonie sono cresciute, in genere rappresentano ceppi clonali puri.
La piastra striata iniziale può contenere colonie provenienti da cellule di diverse specie batteriche o cellule con diverso corredo genetico, a seconda della purezza del campione. Attraverso il successivo isolamento di una singola colonia, dove tutte le unità sono derivate da una cellula madre comune, la seconda procedura di striatura genera una popolazione batterica relativamente clonale, adatta per un'ulteriore caratterizzazione o inoculazione in brodo.
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Results
La stestra iniziale può contenere colonie provenienti da cellule con diverso corredo genetico o (a seconda della purezza del campione) da diverse specie batteriche (Figura 2A).
Attraverso il successivo isolamento di una singola colonia, dove tutte le unità sono derivate da una comune cellula madre, la seconda procedura di striatura genera una popolazione batterica relativamente clonale, adatta per un'ulteriore caratterizzazione o inoculazione in brodo (Figura 2B).
Figura 2: Una cultura pura può essere generata da un campione misto attraverso l'isolamento di una singola colonia appartata. A) La crescita di una singola cellula batterica (CFU) ha generato una colonia clonale, separata da quelle di altre specie e ceppi. Questo CFU è stato utilizzato per la successiva strisciatura su una nuova piastra B) Una seconda piastra, dove la popolazione batterica è costituita esclusivamente da cellule derivate dal CFU iniziale.
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Applications and Summary
La capacità di ottenere e coltivare una colonia batterica pura è essenziale, sia in ambito clinico che accademico. La streak plating consente l'isolamento di una popolazione di cellule relativamente clonali, originata da un CFU condiviso, che può essere di particolare interesse durante la diagnosi o per un'ulteriore caratterizzazione dell'isolato. Un campione viene striato su un mezzo nutritivo a base di agar adatto e incubato fino a quando le colonie diventano visibili. Una colonia isolata viene successivamente raccolta e ri-striata su un secondo piatto.
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References
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