Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar imagens ao vivo e métodos simples de quantificação para analisar a morfologia das células epiteliais embrionárias. Isso é feito primeiro preparando todas as ferramentas e aparelhos. A segunda etapa do procedimento é extirpar X explanação de embriões de rã e abrigá-los em câmaras para cultura de longo prazo.

A terceira etapa do procedimento é coletar imagens de alta resolução de células epiteliais em tempo real. A etapa final do procedimento é quantificar detalhes morfológicos das células epiteliais usando a Imagem J. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram áreas celulares rastreadas e intensidades de membrana por meio de microscopia confocal de alta resolução. Olá, sou Sagar Joshi, do Laboratório Davidson do Departamento de Bioengenharia da Universidade de Pittsburgh.

Hoje mostraremos um procedimento para imagens de células vivas e análise quantitativa de células epiteliais embrionárias de Xenos lavia. Usamos este procedimento para estudar as alterações do citoesqueleto celular em tempo real. Então vamos começar.

Para preparar câmaras para cultivar tampas de animais, use graxa de silicone para selar uma câmara de acrílico personalizada ou uma pequena arruela de náilon em uma grande lamínula de 45 por 50 milímetros. Adicione um mililitro de 1% BSA em um terço de XMBS à câmara. Cubra pequenos fragmentos de lamínula com a mesma solução e incube por duas a quatro horas em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius.

Para reduzir a aderência do explanador X ao vidro, enxágue e encha a câmara com meio DFA até pouco antes de transferir para O xs, enxágue os fragmentos da lamínula da mesma maneira. Em seguida, mergulhe-os em uma placa de embriões de cultura DFA que foram microinjetados no estágio de uma a quatro células com o MR NA desejado para o estágio desejado em um terço de XMBS. Use uma pipeta de transferência com uma abertura inclinada para transferir os embriões para uma placa de DFA sob um microscópio estereoscópico de dissecação.

Use fórceps para dimensionar os embriões para extirpar uma planta CapEx animal. Use um laço de cabelo para apoiar um embrião em uma posição. Use uma faca de cabelo para fazer uma pequena incisão no poste do animal.

Faça cortes suaves repetidos para estender a incisão e remover o ectoderma da tampa. Extirpar três ou quatro vezes explanar da mesma maneira. E use uma pipeta de transferência para movê-los para a câmara de cultura preparada.

Usando a alça de cabelo, posicione cada explanação em X de modo que o epitélio fique voltado para o fundo da câmara. Usando fórceps. Segure um fragmento de lamínula no centro.

Mergulhe as pontas em graxa de silicone. Coloque um fragmento sobre cada explicação X. Fixe levemente cada fragmento no lugar com pequenas pinceladas de graxa de silicone.

Tomando cuidado para não esmagar completamente a explicação X com força excessiva. Encha a câmara com DFA, cubra as bordas superiores da câmara com graxa de silicone. Em seguida, sele a parte superior com uma lamínula de 24 x 40 milímetros.

Ajuste o nível do DFA dentro da câmara para reduzir as bolhas de ar e use tecido para enxugar qualquer transbordamento. As plantas X agora podem ser cultivadas a longo prazo na câmara selada por um dia em temperatura ambiente, mova a objetiva de 20 x de um microscópio confocal para o lugar. Posicione a câmara que contém a explicação X no microscópio stage e coloque pequenos pesos de equilíbrio na câmara para mantê-la na posição sob campo claro.

Ajuste o foco e use o posicionamento do curso para visualizar as extremidades apicais das células superficiais. Mude para fluorescência e uma objetiva de maior potência. Para coletar imagens únicas ou filmes de lapso de tempo do epitélio explan, ajuste a aquisição para obter a melhor imagem possível.

Consulte a parte escrita deste protocolo para obter dicas sobre ajuste e imagem. Mantendo a potência do laser o mais baixa possível. Capture imagens ou filmes com lapso de tempo do epitélio x explan.

Consulte a parte escrita do protocolo para obter sugestões sobre a coleta de dados. Os arquivos de imagem confocal podem ser extraídos de dados de várias maneiras. Aqui estão dois exemplos de como analisar arquivos de dados usando o software de análise Image J com plug-in de formatos bio.

Para medir a área celular de uma célula epitelial, abra o menu de análise e clique em definir medidas. Selecione a ferramenta de seleção na barra de ferramentas e contorne a célula no menu de análise, selecione ferramentas e, em seguida, o gerenciador de ROI. Para abrir o gerenciador de regiões de interesse, pressione control t.

Para adicionar o contorno ao gerenciador de ROI, selecione e adicione quantos contornos desejar na imagem. Em seguida, clique em salvar para salvar o ROI definido no gerenciador de ROI. Clique em medir.

A janela de resultados agora mostrará as áreas medidas de cada ROI. Para medir a intensidade de uma membrana celular, selecione a ferramenta de linha reta na barra de ferramentas J da imagem. Desenhe uma linha perpendicular através da membrana.

Pressione CTRL T como no exemplo anterior. Para adicionar a seleção ao gerenciador de ROI, abra o menu de análise e clique no perfil de plotagem para gerar um gráfico de intensidades relativas ao longo da linha. Para salvar o gráfico como uma imagem, clique em salvar na nova janela de plotagem exibida.

Puxe para baixo o menu da lista para arquivar e salve como Acabamos de mostrar como criar imagens ao vivo e quantificar células epiteliais embrionárias de CapEx explan de animais extirpados. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de adicionar antibiótico e antibiótico ao AFD. Para desencorajar o crescimento de bactérias e fungos, tome cuidado extra ao pressionar os explantes sob as lamínulas, pois mais do que a pressão necessária pode esmagar o ex explan.

Também é importante lembrar de ter configurações ideais no microscópio confocal para obter dados de imagem de qualidade máxima. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.