98 Views
•
03:15 min
•
October 13, 2023
DOI:
Transcript
Automatically generated
لاستخراج المستقلبات داخل الخلايا من holobiont المجففة بالتجميد ، أضف 400 ميكرولتر من الميثانول البارد 100٪ مع المعايير الداخلية إلى holobiont المجففة بالتجميد. ثم أضف 10 ملليغرام من الخرز الزجاجي المغسول بالحمض وضع الأنبوب في مطحنة حبة مبردة مسبقا. يضاف عند 50 هرتز لمدة ثلاث دقائق.
بعد التحلل ، أضف 600 ميكرولتر من الميثانول البارد والدوامة لمدة دقيقة واحدة. ضع الأنبوب على شاكر المشواة عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. لاستخراج المستقلبات من خلايا symbiodiniacae المجففة بالتجميد المنفصلة ، أضف 200 ميكرولتر من الميثانول البارد مع المعايير الداخلية إلى خلايا symbiodiniacae المجففة.
ثم أضف حبات زجاجية مغسولة بالحمض وضع الأنبوب في مطحنة حبة مبردة مسبقا عند 50 هرتز. بعد ثلاث دقائق ، أضف 800 ميكرولتر من الميثانول والدوامة لمدة 30 ثانية. لاستخراج المستقلب من الأنسجة المضيفة المجففة بالتجميد المنفصلة ، أضف ملليلتر واحد من الميثانول البارد الذي يحتوي على معايير داخلية إلى المادة المضيفة المجففة والدوامة لمدة 20 ثانية.
ثم ضع الأنبوب في حامل أنبوب عائم للصوتنة عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. التالي لتنقية مستخلص المستقلب ، قم بطرد جميع العينات عند 3000 جرام لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة 2 ملليلتر دون إزعاج الحبيبات.
أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من 50٪ ميثانول بارد ودوامة بقوة لمدة دقيقة واحدة. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى ، ثم جمع وتجميع المستخلصات القطبية الطافية مع المستخلصات شبه القطبية من نفس العينة. أجهزة الطرد المركزي المستخلصات المجمعة في 16 ، 100G لمدة 15 دقيقة لإزالة الرواسب.
للتحليل ، قم بإدراج 50 ميكرولترا من كل مستخلص في وعاء زجاجي والتركيز باستخدام مكثف فراغ لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية. كشف تحليل GCMS عن 107 مستقلبات مشروحة في جميع العلاجات ، بما في ذلك مجموعة من الأحماض الأمينية والأحماض العضوية والكربوهيدرات والأحماض الدهنية والمعقمة. K تعني التجميع المحدد لثلاث مجموعات متميزة من العينات.
كانت عينات holobiont وسيطة بين المضيف المنفصل والكسور المتعايشة. على الرغم من أن K تعني التوزيعات العنقودية ، إلا أن الإحداثيات المتوازية وتصور الخريطة الحرارية في الوفرة النسبية للمستقلب تشير إلى أن ملف تعريف holobiont يتطابق بشكل وثيق مع ملف تعريف كسر المضيف يختلف اختلافا كبيرا عن كل من ملفات تعريف المضيف والمتعايش. كانت ملامح المضيف والمتعايش متميزة بشكل كبير عن بعضها البعض مع 100 مستقلب فردي ، تختلف اختلافا كبيرا بين المضيف والكسور المتعايشة.
Read Article
Cite this Article
Matthews, J. L., Bartels, N., Elahee Doomun, S. N., Davy, S. K., De Souza, D. P. Preparation of Metabolites from a Coral Holobiont, Separated Coral Host Tissue, and Symbiodiniaceae Cells for Gas Chromatography-Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e200438, doi:10.3791/200438 (2023).
Copy