98 Views
•
03:15 min
•
October 13, 2023
DOI:
Transcript
Automatically generated
כדי לחלץ מטבוליטים תוך תאיים מהולוביוט ליופילי, הוסף 400 מיקרוליטר של מתנול קר 100% עם תקנים פנימיים להולוביונט הליופילי. לאחר מכן מוסיפים 10 מיליגרם של חרוזי זכוכית שטופים בחומצה ומניחים את הצינור בטחנת חרוזים מצוננת מראש. מכניסים ב-50 הרץ למשך שלוש דקות.
לאחר ליזיס, להוסיף 600 מיקרוליטר של מתנול קר מערבולת במשך דקה אחת. הניחו את הצינור על שייקר רוטיסרי בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. כדי לחלץ מטבוליטים מתאי סימביודיני מופרדים ליופיליים, הוסיפו 200 מיקרוליטר מתנול קר עם תקנים פנימיים לתאי הסימביודיני המיובשים.
לאחר מכן מוסיפים חרוזי זכוכית שטופים בחומצה ומניחים את הצינור בתוסף טחנת חרוזים מצונן מראש ב 50 הרץ. לאחר שלוש דקות, להוסיף 800 מיקרוליטר של מתנול ומערבולת במשך 30 שניות. למיצוי מטבוליטים מרקמת פונדקאי מופרדת ליופילית, יש להוסיף מיליליטר אחד של מתנול קר המכיל תקנים פנימיים לחומר המארח המיובש ולמערבולת למשך 20 שניות.
לאחר מכן הניחו את הצינור במחזיק צינור צף לסונציה בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן לטיהור תמצית מטבוליטים, צנטריפוגה את כל הדגימות ב 3000G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים בזהירות את הסופרנאטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של שני מיליליטר מבלי להפריע לכדור.
השהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מתנול קר 50% ומערבול במרץ למשך דקה אחת. צנטריפוגה שוב, ואז לאסוף ולאגד את תמציות הקוטב supernatant עם תמציות קוטביות למחצה מאותה דגימה. צנטריפוגות את התמציות המצטברות ב 16, 100G למשך 15 דקות כדי להסיר שקעים.
לניתוח, aliquot 50 מיקרוליטר של כל תמצית לתוך זכוכית להוסיף ולהתרכז באמצעות רכז ואקום במשך 30 דקות ב 30 מעלות צלזיוס. ניתוח GCMS גילה 107 מטבוליטים מבוארים בכל הטיפולים, כולל חבילה של חומצות אמינו, חומצות אורגניות, פחמימות, חומצות שומן וסטריליות. K פירושו אשכולות זיהו שלושה אשכולות נפרדים של דגימות.
דגימות ההולוביונט היו מתווכות בין המארח המופרד לבין שברים סימביונטיים. אף על פי ש-K פירושו התפלגות אשכולות, קואורדינטות מקביליות והדמיית מפת חום בשפע היחסי של המטבוליטים הצביעו על כך שפרופיל ההולוביונט התאים יותר לפרופיל השבר המארח היה שונה באופן משמעותי הן מפרופיל המארח והן מפרופיל הסימביונט. פרופילי המארח והסימביונט היו שונים באופן משמעותי זה מזה עם 100 מטבוליטים בודדים, שונים משמעותית בין המארח לשבר הסימביונט.
Read Article
Cite this Article
Matthews, J. L., Bartels, N., Elahee Doomun, S. N., Davy, S. K., De Souza, D. P. Preparation of Metabolites from a Coral Holobiont, Separated Coral Host Tissue, and Symbiodiniaceae Cells for Gas Chromatography-Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e200438, doi:10.3791/200438 (2023).
Copy