Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

כרומטוגרפיית גז - ספקטרומטריית מסות מבוססת מטבולומיקה ממוקדת של דגימות אלמוגים קשים

Published: October 13, 2023 doi: 10.3791/65628
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2
1Climate Change Cluster (C3), University of Technology Sydney, 2Metabolomics Australia, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, The University of Melbourne, 3School of Biological Sciences, Victoria University of Wellington

Summary

במאמר זה אנו מציגים את ההפקה וההכנה של מטבוליטים קוטביים וקוטביים למחצה מהולובונט אלמוגים, כמו גם רקמת מארח אלמוגים מופרדת ושברי תאים Symbiodiniaceae, לצורך ניתוח ספקטרומטריית מסות של כרומטוגרפיית גז.

Abstract

גישות המבוססות על ספקטרומטריית מסות כרומטוגרפיה של גז (GC-MS) הוכיחו את עצמן כחזקות להבהרת הבסיס המטבולי של סימביוזה cnidarian-dinoflagellate וכיצד אלמוגים מגיבים ללחץ (כלומר, במהלך הלבנה הנגרמת על ידי טמפרטורה). פרופיל מטבוליטים במצב יציב של הולוביונט האלמוגים, הכולל את הפונדקאי הקנידריאני ואת המיקרובים הקשורים אליו (Symbiodiniaceae ופרוטיסטים אחרים, חיידקים, ארכאה, פטריות ווירוסים), יושם בהצלחה בתנאי סביבה ועקה כדי לאפיין את המצב המטבולי ההוליסטי של האלמוג.

עם זאת, כדי לענות על שאלות סביב אינטראקציות סימביוטיות, יש צורך לנתח את פרופילי המטבוליטים של מארח האלמוגים וסימביונטות האצות שלו באופן עצמאי, אשר ניתן להשיג רק על ידי הפרדה פיזית ובידוד של הרקמות, ואחריו מיצוי עצמאי וניתוח. בעוד היישום של מטבולומיקה הוא חדש יחסית בתחום האלמוגים, המאמצים המתמשכים של קבוצות מחקר הביאו לפיתוח שיטות חזקות לניתוח מטבוליטים באלמוגים, כולל הפרדת הרקמה המארחת של האלמוגים וסימביונטים של אצות.

מאמר זה מציג מדריך שלב אחר שלב להפרדת הולוביונט ומיצוי מטבוליטים לניתוח GC-MS, כולל שלבי אופטימיזציה מרכזיים שיש לקחת בחשבון. אנו מדגימים כיצד, לאחר ניתוח עצמאי, פרופיל המטבוליטים המשולב של שני השברים (אלמוגים ו- Symbiodiniaceae) דומה לפרופיל של השלם (holobiont), אך על ידי הפרדת הרקמות, אנו יכולים גם לקבל מידע מפתח על חילוף החומרים והאינטראקציות בין שני השותפים שלא ניתן להשיג מהשלם בלבד.

Introduction

מטבוליטים מייצגים את התוצרים הסופיים של תהליכים תאיים, ומטבולומיקה - המחקר של חבילת המטבוליטים המיוצרים על ידי אורגניזם או מערכת אקולוגית נתונה - יכולה לספק מדד ישיר לתפקוד אורגניזם1. זה קריטי במיוחד לחקר מערכות אקולוגיות, אינטראקציות סימביוטיות וכלי שיקום, שכן המטרה של רוב אסטרטגיות הניהול היא לשמר (או לשחזר) פונקציות ספציפיות של שירותי מערכת אקולוגית2. שוניות אלמוגים הן מערכת אקולוגית מימית אחת המדגימה את הערך הפוטנציאלי של מטבולומיקה להבהרת אינטראקציות סימביוטיות ולקישור תגובות פיזיולוגיות של אלמוגים להשפעות ברמת הקהילה וברמת המערכת האקולוגית3. היישום של ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיית גז בתפוקה גבוהה (GC-MS) מוערך במיוחד בשל יכולתו לנתח במהירות מגוון רחב של סוגי מטבוליטים בו זמנית עם סלקטיביות ורגישות גבוהות, לספק זיהוי מורכב מהיר כאשר ספריות ספקטרליות זמינות, ולספק רמה גבוהה של שחזור ודיוק, עם עלות נמוכה יחסית לדגימה.

אלמוגים הם הולוביונטים המורכבים מחיית האלמוגים, אנדוסימביונטים פוטוסינתטיים של דינופלגלאט (משפחה: Symbiodiniaceae4), ומיקרוביוםמורכב 5,6. באופן כללי, הכושר של ההולוביונט נשמר בעיקר באמצעות חילופי מולקולות ואלמנטים קטנים כדי לתמוך בתפקוד המטבולי של כל חבר 7,8,9,10. גישות מטבולומיות הוכחו כחזקות במיוחד להבהרת הבסיס המטבולי של ספציפיות סימביוזה 9,11, תגובת הלבנה לעקה תרמית7,8,12,13, תגובות מחלה 14, תגובות חשיפה לזיהום 15, פוטואקלום 16 ואיתות כימי 17 באלמוגים, כמו גם סיוע בגילוי סמנים ביולוגיים 18,19. בנוסף, מטבולומיקה יכולה לספק אישור רב ערך למסקנות שהוסקו מטכניקות מבוססות DNA ו- RNA 9,20. קיים אפוא פוטנציאל רב לשימוש במטבולומיקה להערכת בריאות השונית ולפיתוח כלים לשימור שוניות3, כגון באמצעות איתור סמנים ביולוגיים מטבוליים של עקה18,19 ולבחינת הפוטנציאל של אסטרטגיות ניהול אקטיבי כגון סובסידיות תזונתיות21.

הפרדת התאים המארח והסימביונט וניתוח פרופילי המטבוליטים שלהם באופן עצמאי, ולא יחד כהולוביונט, יכולים להניב מידע נוסף על אינטראקציות בין בני הזוג, סטטוסים פיזיולוגיים ומטבוליים עצמאיים, ומנגנונים מולקולריים פוטנציאליים להסתגלות 11,12,22,23,24. מבלי להפריד בין האלמוגים לבין Symbiodiniaceae, כמעט בלתי אפשרי להבהיר את תרומתם וחילוף החומרים של אלמוגים ו / או Symbiodiniaceae באופן עצמאי, למעט שחזור גנום מורכב ומידול מטבולי25, אך זה עדיין לא יושם על סימביוזה אלמוג-dinoflagellate. יתר על כן, ניסיון לחלץ מידע על חילוף החומרים האישי של הפונדקאי או סימביונט אצות מפרופיל המטבוליטים של ההולוביונט יכול להוביל לפרשנות שגויה.

לדוגמה, עד לאחרונה, הנוכחות של חומצות שומן רב בלתי רוויות C18:3n-6, C18:4n-3 ו-C16 בתמציות מרקמות אלמוגים והולוביונט נחשבה כנגזרת מסימביונט האצות, שכן ההנחה הייתה שלאלמוגים אין את ωx desaturases החיוני לייצור חומצות שומן אומגה-3 (ω3); עם זאת, ראיות גנומיות עדכניות מצביעות על כך שלקנידארים מרובים יש את היכולת לייצר ω3 PUFA de novo ולבצע ביוסינתזה נוספת של ω3 PUFA26 ארוך שרשרת. שילוב GC-MS עם תיוג איזוטופי יציב (למשל, 13 C-ביקרבונט, NaH 13CO 3) יכול לשמשלמעקב אחר גורלו של פחמן קבוע פוטוסינתטי באמצעות רשתות מטבוליות הולוביונט אלמוגים הן בתנאי בקרה והן בתגובה לגורמי עקה חיצוניים27,28. עם זאת, שלב קריטי במעקב אחר גורל 13 C הוא הפרדת רקמת האלמוג מתאי האצות – רק אז ניתן להקצות באופן חד משמעי נוכחות של תרכובת המסומנת ב-13C בחלק המארח של האלמוגים כמטבוליט שמקורו ב-Symbiodiniaceae המועתק לאלמוג או כתוצר במורד הזרם של תרכובת מסומנת שעברה. טכניקה זו הוכיחה את כוחה על ידי קריאת תיגר על ההנחה ארוכת השנים כי גליצרול הוא הצורה העיקרית שבה פוטוסינתאט מועבר מסימביונט למארח29, כמו גם הבהרה כיצד שטף תזונתי בין שותפים משתנה במהלך הלבנה27,28 ובתגובה למיני Symbiodiniaceae11 שאינם תואמים.

בעוד שההחלטה להפריד רקמות מונעת בעיקר על ידי שאלת המחקר, חשוב לקחת בחשבון את המעשיות, האמינות וההשפעות המטבוליות הפוטנציאליות של גישה זו. כאן, אנו מספקים שיטות מפורטות ומוכחות להפקת מטבוליטים מההולוביונט, כמו גם את השברים המארח והסימביונט הנפרדים. אנו משווים את פרופילי המטבוליטים של המארח והסימביונט באופן עצמאי וכיצד פרופילים אלה בהשוואה לפרופיל המטבוליט של הולוביונט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: תכנון הניסוי, איסוף הדגימות ואחסונם תוארו בפירוט במקומות אחרים 2,30,31. יש לקבל אישור לאיסוף אלמוגי בר לפני איסוף וניסויים. הדגימות כאן נאספו ממושבות של Montipora mollis (שינוי צורה בצבע ירוק) שיובאו מחוות האלמוגים Batavia (Geraldton, WA), שנאספו במקור משונית ליד איי אברוהלוס (מערב אוסטרליה; 28°52'43.3"S 114°00'17.0"E) בעומק של 1 מ 'תחת רישיון חקלאות ימית AQ1643. לפני הדגימה, המושבות הוחזקו באקווריום של 800 ליטר ב 35 PSU, תחת אור כחול לבן ב 150 μmol פוטונים ·m −2·s −1, וב 25 ° C ± 0.5 ° C במשך 3 חודשים. שברי האלמוגים (~5 ס"מ2, N=6) הוקפאו בחנקן נוזלי ואוחסנו בטמפרטורה של 80°C עד לעיבודם.

1. הכנת פתרונות החילוץ והציוד

  1. לפחות יום אחד לפני הסרת רקמת האלמוגים, הכינו את פתרונות החילוץ והציוד.
  2. יש להכין מים אולטרה-טהורים בכלי זכוכית נקיים ללא חומרי ניקוי בטמפרטורה של 4°C.
  3. ערבבו מתנול 100% LC עם ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם·מ"ל−1 של תקנים פנימיים מתאימים (למשל, 13C6 סורביטול).
  4. צור תמיסת מיצוי מתנול 50% באמצעות חצי מתנול 100% LC וחצי מים טהורים במיוחד. אחסנו את שתי תמיסות המתנול בטמפרטורה של -20°C.
    הערה: כדי לסייע במניעת פירוק המטבוליטים, מומלץ לבצע את שלבי עיבוד הדגימה באצוות של חמישה מקטעי אלמוגים בכל פעם, עם אחד ביולוגי נוסף (מים בלבד) ריק (סה"כ דגימות N = 6). לאחר שכל דגימת אלמוגים הופרדה לשני השברים (רקמת אלמוג מארח, מעתה "מארח", ותאי מיקרו-אצות, מעתה "סימביונט"), המספר הכולל של דגימות באצוות עיבוד אחת יהיה 12.

2. מטבוליזם אלמוגים מרווה

הערה: תכנון הניסוי, איסוף הדגימות ואחסונם תוארו בפירוט במקומות אחרים 2,30,31. עם זאת, יש לציין כי הזמן שלוקח להרוות את חילוף החומרים (כלומר, הזמן בין איסוף דגימות האלמוגים ושימורן) הוא קריטי כדי ללכוד את התגובה המקורית30. שמור על הדגימה מהר ככל האפשר לאחר האיסוף כדי למנוע שינויים בהרכב המטבוליטים עקב התפרקות הדגימה או תגובות פיזיולוגיות שאינן מטרה32.

  1. הניחו את שברי האלמוגים בשקית איסוף דגימות סטרילית, ונקזו את עודפי מי הים ככל האפשר. יש לטבול את הדגימה בחנקן נוזלי למשך 30 שניות לפחות. העבירו את הדגימות בהקדם האפשרי למקפיא בטמפרטורה של 80°C לאחסון.
    הערה: ניתן להקפיא דגימות בטמפרטורה של -80°C במיכלים חסומים לאור עד לעיבוד, תוך הימנעות ממחזורי הקפאה-הפשרה.

3. הסרת רקמת אלמוג מהשלד

הערה: הדגימות צריכות להישמר על קרח (4 ° C) בכל עת כדי להבטיח שהן בו זמנית בצורה נוזלית תוך מניעת חילוף חומרים מתמשך.

  1. הניחו שקית איסוף דגימות נקייה וסטרילית על קרח כך שהשקית תהיה יציבה ופתוחה על גבי הקרח בבאר רדודה אך לא תהיה שקועה בקרח. הוסיפו 10 מ"ל מים אולטרה-טהורים קרים (4°C) לשקית.
    הערה: זה יעזור למנוע הפשרה חוזרת ונשנית של שבר האלמוגים בהקפאה בגלל האוויר בלחץ קר והקרח שמסביב.
  2. בחרו שבר אלמוגים בפינצטה מעוקרת, ושטפו במים אולטרה-טהורים קרים (4°C) באמצעות פיפטת פסטר סטרילית עד שלא יישארו שאריות מי ים. השקיעו את שבר האלמוגים השטופים בשקית המכילה 10 מ"ל של מים טהורים במיוחד.
    הערה: שטיפה זו חיונית להסרת שאריות מלחים שיפריעו לניתוח במורד הזרם. הימנע ממגע יד עם המים או שבר האלמוגים דרך השקית כדי לשמור על הדגימה ב -4 מעלות צלזיוס.
  3. הדביקו קצה פיפטה סטרילי בנפח 1 מ"ל על קצה אקדח אוויר בעזרת סרט חשמלי, כאשר ~5 מ"מ נחתכו מקצה הקצה (איור 1A).
  4. כוונו את אקדח האוויר אל שבר האלמוג כאשר השקית אטומה למחצה וזרימת האוויר על נמוכה-בינונית כדי להסיר בעדינות את הרקמה על ידי עידוד תנועה מעגלית של המים מעל שבר האלמוג.
  5. לאחר ~3 דקות, או כאשר נראה שכל הרקמה הוסרה מהשלד, כבו את האוויר והוציאו את מברשת האוויר. אטמו לחלוטין את השקית.
  6. סחטו את כל רקמת האלמוגים שהוסרה לפינה התחתונה של השקית. חותכים את הפינה הנגדית ושופכים בעדינות את תכולת השקית לתוך צינור 15 מ"ל על קרח.

4. הומוגניזציה אופציונלית

הערה: חלק ממיני האלמוגים צמיגים יותר מאחרים, כלומר צחצוח האוויר יסיר את הרקמה בגושים במקום בתרחיץ. אם גושי רקמה נראים בהומוגנט המוברש באוויר, ניתן להוסיף שלב הומוגניזציה ב -4 מעלות צלזיוס לכל הדגימות.

  1. נקו פעמיים הומוגנייזר מכני עם שיני מסור עם 4°C 70% מתנול ולבסוף עם 4°C מים טהורים במיוחד.
  2. הומוגניזציה של דגימת האלמוגים בצינור של 15 מ"ל למשך ~1 דקות עד שהדגימה הומוגנית לחלוטין ולא נראים גושים.
  3. נקה את ההומוגנייזר כמו בשלב 4.1 בין כל דגימה. שמור על זמן הומוגניזציה עקבי בין הדגימות.

5. איסוף דוגמאות לנורמליזציה

  1. אספו אליציטוט של 1,000 μL מהרקמה ההומוגנית לצורך ספירת תאים של Symbiodiniaceae, ניתוח תכולת חלבון ברקמת מארח האלמוגים והערכת כלורופיל. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C עד להכנה לניתוח (סעיף 10).

6. רקמת מארח אלמוגים אופציונלית - הפרדת תאים Symbiodiniaceae

  1. צנטריפוגה של האלמוגים הומוגנט ב 2,500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C באמצעות צנטריפוגה בקירור.
    הערה: מהירות זו אופטימלית להפרדת תאי Symbiodiniaceae הכבדים יותר, תוך שמירה על דפנות התא שלהם שלמות, מרקמת המאכסן, אשר תלויה בסופרנטנט.
  2. מוציאים את הסופרנאטנט המכיל את החומר המארח, ומניחים בצינור חדש של 15 מ"ל.
    הערה: השומנים מרקמת המאכסן יוצרים בדרך כלל שכבה ורודה/לבנה צרה על גבי התאים הסימביונטיים. השכבה הזו יכולה להיאסף יחד עם הסופרנאטנט המארח המסיס באמצעות פיפטינג (איור 1B).
  3. מערבלים במרץ את המארח במשך דקה אחת בדיוק. שמור את דגימת גלולת האצות ואת דגימת הסופרנאטנט המארח על קרח.
  4. הוסף 2 מ"ל של מים טהורים במיוחד ב 4 ° C לגלולת האצות. מערבלים במרץ במשך 2 דקות בדיוק כדי להשעות מחדש את הכדור.
    הערה: אם לא נאספו מקטעים בודדים של 1 ס"מ ממושבת האלמוגים עבור גנוטיפ Symbiodiniaceae, ניתן לאסוף כאן אליציטוט של 200 μL של תרחיף התא Symbiodiniaceae, להישמר בתמיסת חיץ הדנ"א המועדפת, ולאחסן כמתואר ב-Thurber et al.30 עבור גנוטיפ Symbiodiniaceae (למשל, לפי González-Pech et al.12).
  5. חזור על שלבים 6.1-6.4 פעם נוספת.
    הערה: ההפרדה האמינה בין הפונדקאי לסימביונט תלויה בביומסה ובמין האלמוגים, מאחר שמינים מסוימים יכולים להיות צמיגים יותר מאחרים. מומלץ לבצע לפחות שלושה שלבי שטיפה, אך ניתן להגדיל זאת בהתאם להצלחת ההפרדה. חזרו על שלבי השטיפה 4.7-4.9 עד שלא ניתן לראות תאי Symbiodiniaceae בתחתית החלק המארח ועד שהמקטע Symbiodiniaceae יהיה נקי באופן גלוי מחומר מארח (למשל, ללא שכבה לבנה למעלה) (איור 1).
  6. מוציאים את הסופרנאטנט המכיל את החומר המארח, ומניחים בצינור חדש של 15 מ"ל.
  7. שמור את גלולת הסימביונט בצינור 15 מ"ל.

7. ייבוש לדוגמה

  1. הקפיאו את ההומוגנט של ההולוביונט או את שני הפונדקאי המופרד ואת שברי Symbiodiniaceae, בטמפרטורה של -80°C למשך ~120 דקות. Lyophilize הדגימות לילה עם ואקום 0.01 mbar ב -85 ° C.
    הערה: כדי למנוע אובדן דגימה במהלך ליופיליזציה, מומלץ להשתמש במכסה שנחתך מצינור סטרילי אחר, או פרפילם סטרילי, עם חור ~ 2 מ"מ מנוקב בזהירות באמצעות מחט סטרילית של 25 גרם.
  2. כאשר יבש, באמצעות איזון מעבדה, לשקול אחד מהבאים: 1) 25 מ"ג של holobiont; 2) 15 מ"ג של חלק סימביונט; או 3) 30 מ"ג של הרקמה המארחת מכל דגימה לצינורות מיקרוצנטריפוגות נפרדים ללא פלסטיסייזר 2 מ"ל.
    הערה: שלב קריטי: אופטימיזציה של הביומסה למיצוי חיונית כדי להבטיח כי GC-MS אינו עמוס יתר על המידה תוך הבטחת אות מספיק. חומר האלמוגים המיובש הוא סטטי מאוד. כדי למנוע אובדן דגימה, השתמש בהתקנים אנטי-סטטיים כדי לסלק מטענים אלקטרוסטטיים מהדגימות ומכלי השקילה. חלופה פשוטה וחסכונית היא להניח סדין מייבש כביסה מתחת לצינור הדגימה. את גלולת הסימביונט המיובשת ניתן לחתוך למשקל הרצוי באמצעות להב סטרילי.

8. מיצוי מטבוליטים תוך תאיים

  1. מיצוי מטבוליטים תוך תאיים מהולובונט ליופילי:
    1. הוסף 400 μL של מתנול 100% קר (-20°C) עם תקן פנימי (IS; 13C6 סורביטול ו / או 13C5-15 N ואלין, ב 10מיקרומטר) לכל צינור.
    2. הוסף מספר קטן של 710-1,180 מיקרומטר חרוזי זכוכית שטופים בחומצה (~ 10 מ"ג) לכל דגימה. מניחים בטחנת חרוזים בטמפרטורה של 50 הרץ למשך 3 דקות בתוסף טחנת חרוזים מקורר מראש (-20°C).
    3. הוסף 600 μL נוסף של מתנול 100% קר (-20 ° C) עם ISs (13 C6 סורביטול ו / או 13C 5-15 N ואלין, ב 10μM) לכל צינור.
    4. מערבבים במשך דקה. מניחים על שייקר רוטיסרי בטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות.
  2. מיצוי מטבוליטים תוך תאיים מתאי Symbiodiniaceae מופרדים מליופיליה:
    1. הוסף 200 μL של מתנול 100% קר (-20 ° C) עם ISs (13 C6 סורביטול ו / או 13C 5-15 N ואלין, ב 10μM) לחומר מיובש Symbiodiniaceae.
    2. הוסף מספר קטן של 710-1,180 מיקרומטר חרוזי זכוכית שטופים בחומצה (~ 10 מ"ג). מניחים בטחנת חרוזים בטמפרטורה של 50 הרץ למשך 3 דקות בתוסף טחנת חרוזים מקורר מראש (-20°C).
    3. הוסף 800 μL נוספים של מתנול 100% קר (-20 ° C) עם ISs, ומערבולת במשך 30 שניות.
  3. מיצוי מטבוליטים תוך תאיים מרקמת פונדקאי מופרדת ליופילית:
    1. הוסף 1 מ"ל של 100% קר (-20 ° C) מתנול כיתה LC המכיל ISs (13 C6 סורביטול ו / או 13C 5-15 N ואלין, ב 10מיקרומטר) לחומר המארח המיובש.
    2. מערבולת לערבב במשך 20 שניות. יש להניח במחזיק צינור צף באמבט סוניקציה בטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות.

9. טיהור תמצית מטבוליטים

  1. צנטריפוגה את הדגימות (holobiont/host/symbiont) ב 3,000 × גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C.
  2. מעבירים את כל הסופרנאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 2 מ"ל, תוך זהירות שלא להפריע לכדורית פסולת התא.
    הערה: אלה הן תמציות קוטביות למחצה. אלה יכולים להישמר על קרח באופן זמני אך מאוחסנים לטווח ארוך ב -80 מעלות צלזיוס בחושך.
  3. לפסולת התא הנותרת, הוסיפו 1,000 מיקרוליטר מתנול קר (-20°C). מערבלים במרץ במשך דקה אחת כדי להשהות מחדש.
  4. צנטריפוגה הדגימות ב 3,000 × גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C.
  5. אספו ואגרו את הסופרנאטנט (תמציות קוטביות) עם תמציות קוטביות למחצה מאותה דגימה.
    הערה: פסולת התא יכולה להיות מאוחסנת בטמפרטורה של -80°C ולהשתמש בה לנורמליזציה של תכולת החלבונים (סעיף 11).
  6. צנטריפוגה את התמציות המצטברות ב 16,100 גרם למשך 15 דקות כדי להסיר את כל המשקעים, ולהעביר את supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש ללא פלסטיסייזר (2 מ"ל).
    הערה: ניתן לאחסן את תמציות הדגימה בטמפרטורה של -80°C בחושך.
  7. כאשר מוכן לנתח, aliquot 50 μL של כל תמצית לתוך תוספת זכוכית. יש להתרכז למשך 30 דקות ב-30°C באמצעות רכז ואקום. יש לחזור על הפעולה ארבע פעמים נוספות (לקבלת 250 מיקרוליטר של תמצית מיובשת כוללת).
    הערה: ניתן לאחסן את הדגימות המיובשות בטמפרטורת החדר בתנאי ייבוש עד לניתוח.

10. מטבוליט derivatization

הערה: תהליך דה-ריוואטיזציה מקוון דו-שלבי משמש למתוקסימציה וטרימתילסילציה של מטבוליטים קוטביים.

  1. הוסף 25 μL של methoxyamine hydrochloride (30 מ"ג / מ"ל בפירידין) לכל דגימה.
  2. יש להתסיס ב-37°C בשייקר מסלולי, שנקבע ב-750 סל"ד למשך שעתיים.
  3. הוסף 25 μL של N,O-bis (trimethylsilyl)trifluoroacetamide + trimethylchlorosilane לכל דגימה.
  4. יש להתסיס שוב ב-37°C וב-750 סל"ד למשך שעה.
  5. אפשרו לדגימות להתאזן בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לפני הזרקת 1 μL ביחס פיצול של 1:10 על ה-GC.

11. כרומטוגרפיית גז-ניתוח ספקטרומטריית מסות

הערה: יש לכוונן את ספקטרומטר המסות בהתאם להמלצות היצרן באמצעות tris-(perfluorobutyl)-amine (CF43).

  1. השתמש בהליום בעל טוהר גבוה במיוחד כגז המוביל בקצב זרימת עמוד קבוע של 1 מ"ל/דקה.
  2. השתמש בעמוד DB-5 באורך 30 מ' עם עובי סרט של 1 מיקרומטר וקוטר פנימי של 0.25 מ"מ.
  3. תוכנית תנור GC
    1. הגדר את טמפרטורת הכניסה ל 280 ° C.
    2. מתחילים בהזרקה בטמפרטורת תנור של 100 מעלות צלזיוס, ומחזיקים 4 דקות.
    3. יש להעלות את הטמפרטורה ב-10°C/min ל-320°C ולאחר מכן להחזיק למשך 11 דקות.
  4. פרמטרים של ספקטרומטר מסה
    1. הגדר את קו ההעברה של MS ל- 280°C וכוונן את מקור היונים ל- 200°C.
    2. השתמש בארגון כגז תא התנגשות כדי ליצור את יון המוצר ניטור תגובה מרובה (MRM).
    3. השג זיהוי מטבוליטים ביחס לספריית MRM מקוטעת בזמן המכילה יעדי MRM.

12. ספירת תאי Symbiodiniaceae, ניתוח תכולת חלבון ברקמת מארח האלמוגים והערכת כלורופיל A

  1. ספירת תאי Symbiodiniaceae:
    1. קח aliquot של רקמת האלמוג homogenate.
    2. צנטריפוגה את הדגימות ב 2,000 × גרם כדי להניף את האצות.
    3. הסר את הסופרנאטנט ~ 200 μL מגלולת האצות, והכנס לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
      הערה: זו תהיה דגימת החלבון שתשמש לנרמול הנתונים; אחסנו אותו בטמפרטורה של -20°C לפני הניתוח, במידת הצורך.
    4. יש להשהות מחדש את כדורית האצות ב-1 מ"ל של מי ים מסוננים על-ידי פיטום עדין למעלה ולמטה. במידת הצורך, דללו את תרחיף האצות כדי להקל על ספירת התא.
    5. בצע ספירת תאים באמצעות המוציטומטר תחת מיקרוסקופ אור על ידי הוספת 10 μL לאחד החדרים. השלם 8-10 ספירות לכל מדגם.
      הערה: ניתן ליישם גם שיטות חלופיות לספירת תאי אצות כאשר הן זמינות (למשל, ציטומטריית זרימה, מיקרוסקופ קונפוקלי בתפוקה גבוהה).
    6. חשב את ריכוז התאים הסימביונטים (mL−1), תוך התחשבות בכל גורמי הדילול המשמשים.
  2. בדיקה עבור תכולת החלבון
    1. לכמת את תכולת החלבון בדגימה (למשל, באמצעות הבדיקה הקולרימטרית של ברדפורד, כפי שתוארה בתחילה על ידי Bradford et al.33, או בדיקת לורי34,35, שהפרוטוקול שלה תואר עבור cnidarians במקומות אחרים 36).
  3. כלורופיל מיצוי
    1. השתמש גלולה תא של ~ 200, 000 תאים, קפוא או טרי.
    2. מעבירים כל כדורית אצות ל-2 מ"ל של דימתילפורממיד (DMF) בבקבוקון זכוכית, ודגרים בחושך ב-4°C למשך 48 שעות.
      הערה: DMF הוא רעיל ומסרטן, ולכן יש להשלים את הכנת הדגימה תחת מכסה אדים כהה ככל האפשר ועל קרח. אם יש <200,000 תאים, השתמש בפחות DMF.
    3. צנטריפוגה למשך 3 דקות ב 16,000 × גרם.
    4. העבר 200 מ"ל לתוך צלחת באר UV-96 למדידות פוטומטריות. הפעל כל דגימה במשולש עם DMF כפריט הריק.
    5. מדוד את הבליעה באורכי גל (E) 663.8 ננומטר, 646 ננומטר ו-750 ננומטר. הפחיתו את הבליעה ב-750 ננומטר מהבליעה בשני אורכי הגל האחרים.
      הערה: מדידה ב-750 ננומטר מתקנת כל פיזור או עכירות בדגימה.
    6. חשב את ריכוז הכלורופיל A (מק"ג/מ"ל) באמצעות משוואה (1):
      Chl ריכוז A (מיקרוגרם / מ"ל) = (12.00 × E 663.8) - (3.11 × E646.8) (1)

13. כימות הביומסה של התא בעקבות מיצוי מטבוליטים לצורך נורמליזציה

הערה: ישנן שתי אפשרויות לכימות ביומסה של התא המתוארות להלן: כימות של חלבון הקשור לביומסה באמצעות שיטה קולורימטרית ברדפורד שונה ומדידת המשקל היבש של פסולת התא. שתי השיטות מתאימות לשימוש, שכן שתיהן מציעות כימות מדויק של הביומסה של התא.

  1. תכולת החלבון של פסולת התא
    1. השהה מחדש את פסולת התאים הקפואה עם 1 מ"ל של 0.2 M NaOH, ודגר על הדגימות ב 98 ° C במשך 20 דקות.
    2. מצננים את הדגימות על קרח למשך ~10 דקות, וצנטריפוגות ב-3,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת הסביבה.
    3. לכמת את תכולת החלבון בדגימה (למשל, באמצעות הבדיקה הקולרימטרית של ברדפורד, כפי שתוארה בתחילה על ידי Bradford et al.33 ושונתה על ידי Smart et al.37).
  2. מדידת משקל יבש של פסולת תאים
    1. השהה מחדש את פסולת התא ממיצוי המטבוליטים התוך תאיים במים מזוקקים פעמיים (~ 10 מ"ל).
    2. סנן את התמיסה תחת ואקום באמצעות מסנן ממברנה שוקל מראש (0.22 מיקרומטר נקבוביות, 47 מ"מ).
    3. שטפו את הצינורות המכילים ביומסה פעמיים במים טהורים במיוחד כדי להבטיח העברה מלאה של ביומסה למסנן הממברנה.
    4. הסר את מסנן הממברנה המכיל את הביומסה וייבש אותו באמצעות תנור מיקרוגל (הספק נמוך; ~ 250 W למשך 20 דקות).
    5. אחסנו את נייר הסינון במייבש למשך הלילה. רשום את המשקל היבש של נייר הסינון וחשב את המשקל היבש של הביומסה על ידי הפחתת משקל מסנן הממברנה היבשה (באמצעות מסנן קרום יבש נקי שיובש לצד מסנן הדגימה) מהמשקל הכולל.

14. ניתוח נתונים

  1. ניתוח יעדי מטבוליטים באמצעות מסדי נתונים מטבוליטים כאשר כל יעד מורכב מ-MRM מכמת ומזהה.
  2. בדוק חזותית את מטרות המטבוליטים שזוהו ושלב אותם ידנית לפי הצורך.
  3. השתמש באזור שיא מטבוליט כדי לחשב את השפע היחסי של כל דגימה עבור כל קבוצה. הערכים ריקים, מתוקנים ומנורמלים כדי לדגום את אזור השיא הסטנדרטי הפנימי, ולאחר מכן לדגום את תכולת חלבון פסולת התא לפי Smart et al.37.
  4. השליכו מטבוליטים עם סטיית תקן יחסית גדולה מ-35% בכל קבוצות הטיפול (N = 23 מטבוליטים).
  5. להפוך את הנתונים (למשל, שורש קובייה), ו מתכוון למרכז אותם; לאשר התפלגות נורמלית והומוגניות של שונות.
  6. בצע את ניתוח הנתונים (ANOVA ובניית מפת חום; למשל, באמצעות https://www.metaboanalyst.ca)38. קבץ את הדגימות כדי לבחון את השונות בתוך הטיפול באמצעות החבילות "cluster", "factoextra" ו- "klustR". חישוב סטטיסטיקת הפער (שיטה לקביעת המספר האופטימלי של אשכולות39) באמצעות הפונקציה "clusGap" ב- R ומגרשים באמצעות חבילת R "tidyverse". בצעו PERMANOVAs כדי לבחון את המשמעות בהפרדה בין פרופילי המטבוליטים של הטיפול (למשל, בפריימר).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כל הנתונים שהופקו במהלך עבודה זו זמינים במידע המשלים.

הפרדה בין מארח לסימביונט

Figure 1
איור 1: הגדרה ותיקוף של ההפרדה בין רקמות מארחות אלמוגים ותאי Symbiodiniaceae. (A) מערך אקדח האוויר לסילוק רקמת אלמוג משלד האלמוג. קצה פיפטה מחובר לאקדח האוויר עם סרט חשמלי, וקטע קטן (~ 5 מ"מ) נחתך מהקצה כדי לאפשר ליותר אוויר לברוח מבלי להזיז את הקצה. (B) דוגמאות של רקמת ההולוביונט והרקמה המארחת המופרדת (supernatant) ותאי Symbiodiniaceae (גלולה). הערך מייצג את מספר שלבי הצנטריפוגה. החץ מצביע על שכבת השומנים הצרה של המארח על גבי גלולת הסימביונט שניתן לאסוף ולשלב עם החלק המארח. (ג-ה) תמונות מיקרוסקופ ברייטפילד (למעלה) וכלורופיל אוטופלואורסצנטי (תחתון) של אליקוט של (C) הולוביונט עם רקמת המאכסן ותאי סימביונט, (D) החלק המארח ללא תאים סימביוטים כפי שאומת על ידי היעדר כל אוטופלואורסצנטיות של כלורופיל, ו-(E) תאים סימביוטים שלמים, המדגימים את הסרת הרקמה המארחת. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הדמיה מיקרוסקופית לא הראתה תאי Symbiodiniaceae בדגימות הרקמה המארחת לאחר שלושת שלבי השטיפה (איור 1D). באופן דומה, הייתה נוכחות מינימלית של רקמת מארח בשברים הסימביונטיים (איור 1E). אולם ההומוגנט של ההולוביונט (איור 1C) הראה שייתכן שהסימביודיאנים התוך-תאיים לא שוחררו כראוי מהסימביוזומים שלהם על-ידי צחצוח אוויר פשוט, ולכן לא במידה מספקת במהלך הומוגניזציה מכנית (פרוטוקול סעיף 4) או מיצוי ממס (פרוטוקול סעיף 8) בהשוואה להפרדה צנטריפוגלית (איור 1E). מגבלה זו יכולה להסביר חלק מהשונות הגדולה בתוך הקבוצה בין דגימות ההולוביונט לבין תצפיות ספציפיות בפרופילי ההולוביונט. לדוגמה, שני מטבוליטים (חומצה גליקולית ו-1-הקסדקנול) היו נפוצים יותר באופן משמעותי בהולוביונטים לעומת סימביונט, אך לא בפונדקאי לעומת סימביונט; ייתכן שזו הייתה תוצאה של השונות הגדולה בתוך הקבוצה בשפע היחסי של מטבוליטים אלה בפרופילי ההולוביונט. בפרט, בדגימת הולוביונט 3 היו ריכוזים גבוהים יחסית של חומצה דודקנואית, חומצה גליקולית ו-1-הקסדקנול מאשר כל דגימת סימביונט או מארח בנפרד. כאשר נתוני אזור שיא המטבוליט מנורמלים לתכולת החלבון, אם התאים הסימביונטים לא נוקו מספיק מרקמת המאכסן, ייתכן שתכולת חלבון ההולוביונט הוערכה בחסר, ובכך השפיעה על נורמליזציה של הביומסה והובילה לחישוב של שפע מטבוליטים גבוה יותר ביחס לביומסה בדגימה זו. זה מדגיש עוד יותר את הפוטנציאל לשונות מוגברת במטבוליקה של הולוביונט.

ניתוח פרופיל מטבוליטים
בחירת מצב ספקטרומטר המסות תלויה בניתוח המבוצע. עבור פרופיל מטבוליטים במצב יציב, מתודולוגיה ממוקדת מקיפה באמצעות QqQ-MS במצב MRM מאפשרת זיהוי וזיהוי מטבוליטים משופרים הודות לסילוק רעשי הרקע שעלולים להיווצר על ידי ריכוזי מלח ביולוגיים גבוהים. עבור גישות תיוג איזוטופים יציבות, ספקטרומטר מסות (כלומר, מרובע יחיד, מרובע משולש [QqQ], זמן טיסה מרובע [QTOF]) הפועל במצב סריקה מאפשר זיהוי איזוטופולוגים של מסה המצביעים על דפוסי העשרה איזוטופיים יציבים.

ניתוח GC-MS ממוקד הושלם באמצעות מסד הנתונים Shimadzu Smart Metabolite Database (v3; המכסה כ-350 מטבוליטים אנדוגניים ותקנים פנימיים איזוטופיים יציבים מרובים) ותוכנת Shimadzu LabSolutions Insight. בכל הטיפולים זוהו 107 מטבוליטים מבוארים, כולל חבילה של חומצות אמינו, חומצות אורגניות, פחמימות, חומצות שומן וסטרובלים (טבלה משלימה S1). צמדי יונים איכותיים וכמותיים מוצגים בטבלה משלימה S2. אשכולות Kmeans זיהו שלושה אשכולות נפרדים של דגימות (שאומתו על ידי מבחן סטטיסטי פער), כאשר כל הדגימות היו באשכולות נפרדים ומובחנים; הסימביונטים היו בצביר 1, המארח בצביר 2, ודגימות ההולוביונט בצביר 3 (איור 2).

Figure 2
איור 2: ניתוח אשכולות Kmeans של פרופילי המטבוליטים. (A) פרופילי המטבוליטים שנדגמו קובצו לפי מרחק אוקלידי במספר האופטימלי של אשכולות (N=3), שאומת באמצעות חישוב סטטיסטי של פערים. (B) הדמיה מקבילית של השפע היחסי הממוצע של המטבוליט (קו, צבוע לפי הצביר) ורווח בר-סמך (הצללה, צבוע לפי הצביר) לכל אשכול (אדום = אשכול 1, ירוק = אשכול 2, כחול = אשכול 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

השוואת פרופיל מטבוליט מארח וסימביונט
פרופילי המארח והסימביונט היו שונים באופן משמעותי זה מזה (PERMANOVA, t = 16.909, p < .001; טבלה משלימה S3), עם 100 מטבוליטים בודדים שונים באופן משמעותי בין המארח לבין שברים סימביוטיים (ANOVA, FDR < 0.05; איור 3 וטבלה משלימה S1). מתוכם, 13 מטבוליטים היו נפוצים יותר באופן משמעותי בסימביונט מאשר תמציות המאכסן, כולל חומצה איקוסנואידית docosahexaenoic (C22:6[ω-6]; DHA), חומצה איקוסאפנטאנואית (C20:5[ω-6]; EPA), וחומצה ארכידונית (C20:4[ω-6]; ארה) (אנובה, FDR < 0.05; איור 3 וטבלה משלימה S1). בסך הכל 87 מטבוליטים היו פחות נפוצים בסימביונט מאשר תמציות המאכסן (ANOVA, FDR < 0.05; איור 3 וטבלה משלימה S1).

Figure 3
איור 3: הדמיה של מפת חום של השפע היחסי של המטבוליטים עם תוצאות ניתוח פוסט-הוק של השוואות הקבוצות. דגימות הפונדקאי, הסימביונט וההולוביונט (N =5 לכל קבוצה) קובצו היררכית באמצעות הקישור של וורד, והמטבוליטים קובצו לפי מדידת מרחק אוקלידית. הריבועים הצבעוניים מצביעים על הבדלים משמעותיים בהשוואות הקבוצתיות שזוהו באמצעות ANOVA עם HSD של Tukey פוסט הוק (טבלה משלימה S1). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

פרופילי מטבוליטים של Holobiont בהשוואה לפרופילי מארח וסימביונט מופרדים
פרופילי המטבוליטים של ההולוביונט הדגימו שונות גדולה בתוך הקבוצה, שהוכחה על ידי ההפרדה הגדולה של דגימות בצביר ההולוביונט בניתוח Kmeans; באופן ספציפי, מדגם 3 ומדגם 4 הופרדו לאורך ממד 2 ממדגם 1, מדגם 2 ומדגם 5 (איור 2A). דגימות ההולוביונט היו מתווכות בין הפונדקאי המופרד לבין שברים סימביונטיים (איור 2A). בעוד שהתפלגויות אשכול Kmeans (איור 2A), קואורדינטות מקבילות (איור 2B) והדמיית מפת חום של השפע היחסי של המטבוליט (איור 3), הצביעו על כך שפרופיל ההולוביונט תאם יותר לפרופיל השבר המארח, פרופיל ההולוביונט היה שונה באופן משמעותי משני הפונדקאי (PERMANOVA, t = 3.47, p < 0.001; טבלה משלימה S3) ופרופילי סימביונט (PERMANOVA, t = 11.29, p < 0.001; טבלה משלימה S3). ברמת המטבוליטים הבודדים, 66 ו-82 מטבוליטים בהולוביונט היו שונים באופן משמעותי מהפרופילים המארח והסימביונט, בהתאמה (ANOVA, FDR < 0.05, Supplementary Table S1). מתוכם, ל-54 (81.8%) מתוך 66 המטבוליטים המשמעותיים היה שפע יחסי גבוה משמעותית בפונדקאי מאשר למקטע ההולוביונט, ול-78 (95%) היה שפע יחסי גבוה משמעותית בהולוביונטים מאשר למקטע הסימביונט; ארבעה מהם היו נפוצים יותר בשברים סימביונטיים, כולל DHA, גליצרול-3-פוספט, אינוזיטול פוספט וחומצה זרחתית (איור 3). שמונה מטבוליטים (כולל שתי חומצות שומן [לינולאית (C18:1) וחומצה מיריסטית (C14:0), חמש חומצות דיקרבוקסיליות וחומצת האמינו גואנין) היו שונים באופן משמעותי בשפע בין המארח לסימביונט, אך לא בהשוואה לחלק ההולוביונט (איור 3).

טבלה משלימה S1: השפע היחסי של כל מטבוליט שזוהה באמצעות ניתוח GC-MS בהולובונט ובפונדקאי וסימביונט המופרד. הערכים הם ממוצע ± שגיאת תקן, ותוצאות ANOVA שסופקו, כולל ניתוח פוסט-הוק, מסומנות על-ידי התאים הצבעוניים (עמודות K, L ו- M). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S2: זוגות יונים איכותיים וכמותיים עבור המטבוליטים שזוהו. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S3: תוצאות PERMANOVA. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההפרדה בין הפונדקאי לסימביונט ניתנת להשגה בקלות ובמהירות באמצעות צנטריפוגה פשוטה, והתוצאות כאן מראות כי הפרדת השברים יכולה לספק מידע רב ערך המעיד על תרומות ספציפיות של חברי הולוביונט, אשר יכול לתרום לניתוח פונקציונלי של בריאות האלמוגים. באלמוגים בוגרים, סינתזת שומנים מבוצעת בעיקר על-ידי סימביונטאצות תושב 40, אשר מספק שומנים (למשל, טריאצילגליצרול ופוספוליפידים)41 וחומצות שומן שיכולות לקדם התאוששות מסטרס 11,42. מתוך 13 מטבוליטים שהיו נפוצים יותר בפרופילים סימביוטיים לעומת מארחים בעבודה זו, 9 היו חומצות שומן, כולל האיקוסנואידים הרלוונטיים ביולוגית DHA (C22:6[ω-6]), EPA (C20:5[ω-6]) ו-ARA (C20:4[ω-6]), אשר מעורבים באיתות עקה בין הממלכה בסימביוזה 9,10 של אלמוגים-סימביודינים. אינוסיטול פוספט ממלא תפקיד מכריע בתפקודים תאיים מגוונים, כולל גדילת תאים, אפופטוזיס, אנדוציטוזה והתמיינות תאים. השפע היחסי של איזופורמים ונגזרות אינוזיטול נמצא לעתים קרובות משתנה במהלך תפקוד לקוי של סימביוזה 7,11,27,28, אם כי תפקידם של איזופורמים אלה ונגזרותיהם בסימביוזה של אלמוגים-Symbiodiniaceae עדיין אינו ברור. לפיכך, ההבדל הברור בשפע היחסי בין פרופיל מארח לפרופיל סימביונט מסייע לתרום לידע זה.

מחקרים רבים השתמשו בפרופילי מטבוליטים של הולוביונט כדי לחקור אינטראקציות מטבוליות של אלמוגים וביצועים בתנאי סביבה ועקה 13,43,44,45. כאן, אנו מראים כי ניתוח של הומוגנט הולוביונט יכול לגרום לשונות גדולה בתוך הטיפול, והפרופילים המתקבלים יכולים להסוות דפוסי שפע ספציפיים למארח ו / או סימביונט ותרומות מטבוליות למטבוליזם הכולל של הולוביונט. לדוגמה, מתוך 13 מטבוליטים שהיו נפוצים יותר באופן משמעותי בסימביונט ביחס לחלק המאכסן, רק 4 היו נפוצים יותר באופן משמעותי בסימביונט ביחס להולוביונט. אלה כללו את DHA ואינוסיטול פוספט 7,9,10,11,27,28 הרלוונטיים ביולוגית; עם זאת, ההבדלים הברורים שנצפו באיקוסנואידים מאותתים ללחץ EPA ו- ARA בין המארח לסימביונט לא היו משמעותיים בדגימות הולוביונט לעומת סימביונט. מטבוליטים אלה מוכרים יותר ויותר כמטבוליטים חשובים בשפה המולקולרית של סימביוזה וכאינדיקטורים לתגובות עקה10, אך בחינת פרופילי הולוביונט בלבד לא תחשוף את השינויים המובהקים ביחסי השפע היחסיים של מטבוליטים אלה בחברי הולוביונט ספציפיים. לכן, ניתוח ההולוביונט יכול להסוות הבדלים שנראים לעין כאשר הפונדקאי והסימביונט מנותחים בנפרד, והבדלים אלה עשויים שלא להתגלות כמשמעותיים במחקרים המשווים טיפולים אביוטיים או ביוטיים אך ורק באמצעות פרופילי הולוביונט. זה יכול להקשות על להסיק תרומות או פונקציות ספציפיות של בני זוג 7,8,9,11,12,22,28, במיוחד כאשר מנסים לענות על שאלות ביולוגיות שעבורן אינטראקציות סימביוטיות עומדות בבסיס פנוטיפ ההולוביונט הנצפה 46,47.

מתודולוגיה חלופית תהיה להפריד את הרקמות המארחות ואת התאים הסימביונטים, לקחת aliquot של הומוגנאט או תמצית של כל שבר כדי לשלב מחדש לפני החילוץ, ולנתח את זה לצד השברים המופרדים; שיטה זו תבטיח שחרור סימביוטים מהרקמות המארחות, אך תגדיל את הפוטנציאל לטעויות אנוש ו/או אובדן מטבוליטים48. ניתוח השברים בנפרד ושילוב הנתונים לאחר ניתוח עשויים להיות אפשריים, אך החישובים יצטרכו לקחת בחשבון את חלקם של תאים סימביונט ומארח בהולוביונט האלמוגים המקורי.

בעוד שניתן לקבל מידע נוסף על ידי הפרדת השברים המארח והסימביונט לצורך ניתוח מטבוליטים, במיוחד במונחים של תרומות איברים בודדים למטבוליזם ולתפקוד של הולוביונט, ההחלטה אם להפריד את המארח לסימביונט במקום לנתח את ההולוביונט היא בסופו של דבר החלטה הנשלטת על ידי שאלת המחקר. לדוגמה, ניתוח פרופיל המטבוליטים של ההולוביונט רלוונטי כאשר מדידות פיזיולוגיות אחרות נלקחות עם ההולוביונט (למשל, ניתוח של פליטות מטבוליטים נדיפים ממושבות אלמוגים 49,50,51) וכאשר פרופילי מטאבולומיקה צריכים להיות משולבים עם מערכי נתונים של הולוביונט. בנוסף, ההפרדה בין המארח לסימביונט אינה נטולת מגבלות; לדוגמה, צעדי מניפולציה נוספים עלולים להפריע ליציבות המטבוליטים ולגרום לאובדן נתונים או להשפעות מבלבלות48.

יתר על כן, ישנם שלבי אופטימיזציה נוספים המעורבים בהליך ההפרדה בין פונדקאי לסימביונט: 1) אופטימיזציה של מספר השטיפות עבור מיני האלמוגים הספציפיים; ו-2) זיהוי הביומסה האופטימלית למיצוי משני השברים לצורך ניתוח GC-MS. יש לכלול את שני השלבים לפני תחילת עיבוד הדגימה הסופי, ובכך להגדיל הן את הדרישות המתכלות והן את הדרישות האנליטיות לחומר, זמן ועלויות. בעבודה זו, אובדן מטבוליטים מהפונדקאי ומיצוי סימביונט עקב השלבים הנוספים עשויים לתרום לשכיחות היחסית הגבוהה יותר של חלק מהמטבוליטים שנצפו בהולוביונטים ביחס למארח או לסימביונט, כגון חומצה גליקולית, 1-הקסדקנול וחומצה דודקנית. עם זאת, השונות הגדולה בתוך הקבוצה בקבוצת ההולוביונט עבור מטבוליטים אלה היא, כאמור, סיבה חלופית לדפוסים נצפים אלה.

היישום של גישות מטאבולומיות, למרות שהוא חדש יחסית, השפיע עמוקות על יכולתנו להבהיר את תפקודן של סימביוזות ספציפיות. לדוגמה, גישה זו חשפה את תרומתו של ההורמון מעודד הצמיחה של פיטופלנקטון אינדול-3 חומצה אצטית, אשר מסונתז על ידי חיידקים בסימביוזה של Pseudo-nitzschia multiseries-Sulfitobacter. יתר על כן, גישה זו הבהירה טרנסלוקציה שמקורה בפונדקאי וסימביונט באלמוגים 11,27,28,29, שיש לה פוטנציאל מרגש לשימור ושיקום שוניות אלמוגים3, כגון באמצעות זיהוי סמנים ביולוגיים 19. כאן, סיפקנו נוהל לשתי הגישות בתקווה שזה יקל ויאיץ את היישום של מטבולומיקה לחקירות עתידיות של שוניות אלמוגים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגוד עניינים לחשוף.

Acknowledgments

J.L.M. נתמך על ידי מלגת מחקר של UTS Chancellor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% LC-grade methanol Merck 439193 LC grade essential
2 mL microcentrifuge tubes, PP Eppendorf 30121880 Polypropylene provides high resistance to chemicals, mechanical stress and temperature extremes
2030 Shimadzu gas chromatograph Shimadzu GC-2030
710-1180 µm acid-washed glass beads Merck
G1152		 This size is optimal for breaking the Symbiodiniaceae cells
AOC-6000 Plus Multifunctional autosampler Shimadzu AOC6000
Bradford reagent Merck B6916 Any protein colourimetric reagent is acceptable
Compressed air gun Ozito 6270636 Similar design acceptable. Having a fitting to fit a 1 mL tip over is critical.
 DB-5 column with 0.25 mm internal diameter column and 1 µm film thickness Agilent 122-5013
DMF Merck RTC000098
D-Sorbitol-6-13C and/or 13C5–15N Valine Merck 605514/ 600148 Either or both internal standards can be added to the methanol.
Flat bottom 96-well plate Merck CLS3614
Glass scintillation vials Merck V7130 20 mL, with non-plastic seal
Immunoglogin G Merck 56834 if not availbe, Bovine Serum Albumin is acceptable
Primer v4
R v4.1.2
Shimadzu LabSolutions Insight software v3.6
Sodium Hydroxide Merck S5881 Pellets to make 1 M solution
tidyverse v1.3.1 R package
TissueLyser LT Qiagen 85600 Or similar
TQ8050NX triple quadrupole mass spectrometer Shimadzu GCMS-TQ8050 NX
UV-96 well plate Greiner M3812
Whirl-Pak sample bag Merck WPB01018WA Sample collection bag; Size: big enough to house a ~5 cm coral fragment, but not too big that the water is too spread

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: A critical review and future perspectives. Metabolomics. 5 (1), 3-21 (2008).
  2. Matthews, J. L., et al. The metabolic significance of symbiont community composition in the coral-algal symbiosis. Applied Environmental Metabolomics. Beale, D. J., Hillyer, K. E., Warden, A. C., Jones, O. A. H. , Academic Press. Cambridge, MA. 211-229 (2022).
  3. Lawson, C. A., et al. Informing coral reef conservation through metabolomic approaches. Coral Reef Conservation and Restoration in the Omics Age. Coral Reefs of the World. van Oppen, M. J. H., Aranda Lastra, M. , Springer. Cham, Switzerland. 179-202 (2022).
  4. LaJeunesse, T. C., et al. Systematic revision of Symbiodiniaceae highlights the antiquity and diversity of coral endosymbionts. Current Biology. 28 (16), 2570-2580 (2018).
  5. Rohwer, F., Seguritan, V., Azam, F., Knowlton, N. Diversity and distribution of coral-associated bacteria. Marine Ecology Progress Series. 243, 1-10 (2002).
  6. Maire, J., et al. Intracellular bacteria are common and taxonomically diverse in cultured and in hospite algal endosymbionts of coral reefs. The ISME Journal. 15 (7), 2028-2042 (2021).
  7. Hillyer, K. E., et al. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in the coral Acropora aspera. Coral Reefs. 36, 105-118 (2016).
  8. Hillyer, K. E., Tumanov, S., Villas-Bôas, S., Davy, S. K. Metabolite profiling of symbiont and host during thermal stress and bleaching in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Journal of Experimental Biology. 219 (4), 516-527 (2016).
  9. Matthews, J. L., et al. Optimal nutrient exchange and immune responses operate in partner specificity in the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), 13194-13199 (2017).
  10. Rosset, S. L., et al. The molecular language of the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Trends in Microbiology. 29 (4), 320-333 (2020).
  11. Matthews, J. L., et al. Partner switching and metabolic flux in a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Royal Society. 285 (1892), 20182336 (2018).
  12. González-Pech, R. A., et al. Physiological factors facilitating the persistence of Pocillopora aliciae and Plesiastrea versipora in temperate reefs of south-eastern Australia under ocean warming. Coral Reefs. 41, 1239-1253 (2022).
  13. Williams, A., et al. Metabolomic shifts associated with heat stress in coral holobionts. Science Advances. 7 (1), (2021).
  14. Deutsch, J. M., et al. Metabolomics of healthy and stony coral tissue loss disease affected Montastraea cavernosa corals. Frontiers in Marine Science. 8, 1421 (2021).
  15. Stien, D., et al. A unique approach to monitor stress in coral exposed to emerging pollutants. Scientific Reports. 10 (1), 9601 (2020).
  16. Lohr, K. E., et al. Resolving coral photoacclimation dynamics through coupled photophysiological and metabolomic profiling. Journal of Experimental Biology. 222 (8), (2019).
  17. Jorissen, H., et al. Coral larval settlement preferences linked to crustose coralline algae with distinct chemical and microbial signatures. Scientific Reports. 11 (1), 14610 (2021).
  18. Roach, T. N., Dilworth, J., Jones, A. D., Quinn, R. A., Drury, C. Metabolomic signatures of coral bleaching history. Nature Ecology & Evolution. 5 (4), 495-503 (2021).
  19. Parkinson, J. E., et al. Molecular tools for coral reef restoration: Beyond biomarker discovery. Conservation Letters. 13 (1), 12687 (2020).
  20. Jiang, J., et al. How Symbiodiniaceae meets the challenges of life during coral bleaching. Coral Reefs. 40, 1339-1353 (2021).
  21. Guerra, F. D., Attia, M. F., Whitehead, D. C., Alexis, F. Nanotechnology for environmental remediation: materials and applications. Molecules. 23 (7), 1760 (2018).
  22. Matthews, J. L., et al. Metabolite pools of the reef building coral Montipora capitata are unaffected by Symbiodiniaceae community composition. Coral Reefs. 39, 1727-1737 (2020).
  23. Papina, M., Meziane, T., van Woesik, R. Symbiotic zooxanthellae provide the host-coral Montipora digitata with polyunsaturated fatty acids. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 135 (3), 533-537 (2003).
  24. Kellogg, R., Patton, J. Lipid droplets, medium of energy exchange in the symbiotic anemone Condylactis gigantea: A model coral polyp. Marine Biology. 75, 137-149 (1983).
  25. Ankrah, N. Y., Chouaia, B., Douglas, A. E. The cost of metabolic interactions in symbioses between insects and bacteria with reduced genomes. mBio. 9 (5), e01433 (2018).
  26. Kabeya, N., et al. Genes for de novo biosynthesis of omega-3 polyunsaturated fatty acids are widespread in animals. Science Advances. 4 (5), (2018).
  27. Hillyer, K. E., Dias, D., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. 13C metabolomics reveals widespread change in carbon fate during coral bleaching. Metabolomics. 14 (1), 12 (2018).
  28. Hillyer, K. E., Dias, D. A., Lutz, A., Roessner, U., Davy, S. K. Mapping carbon fate during bleaching in a model cnidarian symbiosis: the application of 13C metabolomics. New Phytologist. 214 (4), 1551-1562 (2017).
  29. Burriesci, M. S., Raab, T. K., Pringle, J. R. Evidence that glucose is the major transferred metabolite in dinoflagellate-cnidarian symbiosis. Journal of Experimental Biology. 215 (19), 3467-3477 (2012).
  30. Thurber, R. V., et al. Unified methods in collecting, preserving, and archiving coral bleaching and restoration specimens to increase sample utility and interdisciplinary collaboration. PeerJ. 10, 14176 (2022).
  31. Grottoli, A. G., et al. Increasing comparability among coral bleaching experiments. Ecological Applications. 31 (4), 02262 (2020).
  32. Mushtaq, M. Y., Choi, Y. H., Verpoorte, R., Wilson, E. G. Extraction for metabolomics: access to the metabolome. Phytochemical Analysis. 25 (4), 291-306 (2014).
  33. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1), 248-254 (1976).
  34. Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
  35. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
  36. Zamer, W. E., Shick, J. M., Tapley, D. W. Protein measurement and energetic considerations: Comparisons of biochemical and stoichiometric methods using bovine serum albumin and protein isolated from sea anemones. Limnology and Oceanography. 34 (1), 256-263 (1989).
  37. Smart, K. F., Aggio, R. B., Van Houtte, J. R., Villas-Boas, S. G. Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 5 (10), 1709-1729 (2010).
  38. Pang, Z., et al. Using MetaboAnalyst 5.0 for LC-HRMS spectra processing, multi-omics integration and covariate adjustment of global metabolomics data. Nature Protocols. 17 (8), 1735-1761 (2022).
  39. Tibshirani, R., Walther, G., Hastie, T. Estimating the number of clusters in a data set via the gap statistic. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Statistical Methodology). 63 (2), 411-423 (2001).
  40. Chen, W. -N., et al. Diel rhythmicity of lipid-body formation in a coral-Symbiodinium endosymbiosis). Coral Reefs. 31 (2), 521-534 (2012).
  41. Imbs, A. Fatty acids and other lipids of corals: composition, distribution, and biosynthesis. Russian Journal of Marine Biology. 39 (3), 153-168 (2013).
  42. Rosset, S., et al. Lipidome analysis of Symbiodiniaceae reveals possible mechanisms of heat stress tolerance in reef coral symbionts. Coral Reefs. 38 (6), 1241-1253 (2019).
  43. Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Del Angel-Rodriguez, J. A., Perez-Espana, H. Seasonal shifts in fatty acids and sterols in sponges, corals, and bivalves, in a southern Gulf of Mexico coral reef under river influence. Coral Reefs. 40 (2), 571-593 (2021).
  44. Imbs, A. B., Dang, L. T. Seasonal dynamics of fatty acid biomarkers in the soft coral Sinularia flexibilis, a common species of Indo-Pacific coral reefs. Biochemical Systematics and Ecology. 96, 104246 (2021).
  45. Oku, H., Yamashiro, H., Onaga, K., Sakai, K., Iwasaki, H. Seasonal changes in the content and composition of lipids in the coral Goniastrea aspera. Coral Reefs. 22 (1), 83-85 (2003).
  46. Weis, V. M. Cell biology of coral symbiosis: foundational study can inform solutions to the coral reef crisis. Integrative and Comparative Biology. 59 (4), 845-855 (2019).
  47. Oakley, C., Davy, S. Cell biology of coral bleaching. Coral Bleaching. van Oppen, M., Lough, J. , Springer. Cham, Switzerland. 189-211 (2018).
  48. Lu, W., et al. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  49. Lawson, C. A., et al. Heat stress decreases the diversity, abundance and functional potential of coral gas emissions. Global Change Biology. 27 (4), 879-891 (2021).
  50. Olander, A., et al. Comparative volatilomics of coral endosymbionts from one-and comprehensive two-dimensional gas chromatography approaches. Marine Biology. 168 (5), 76 (2021).
  51. Wuerz, M., et al. Symbiosis induces unique volatile profiles in the model cnidarian Aiptasia. Journal of Experimental Biology. 225 (19), (2022).

Tags

כרומטוגרפיית גזים-ספקטרומטריית מסות מטבולומיקה ממוקדת דגימות אלמוגים קשים בסיס מטבולי סימביוזה של Cnidarian-dinoflagellate הלבנה הנגרמת על ידי טמפרטורה פרופיל מטבוליטים במצב יציב הולוביונט אלמוגים אינטראקציות סימביוטיות פרופילי מטבוליטים הפרדה פיזית בידוד רקמות מיצוי מטבוליטים ניתוח GC-MS שלבי אופטימיזציה
כרומטוגרפיית גז - ספקטרומטריית מסות מבוססת מטבולומיקה ממוקדת של דגימות אלמוגים קשים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Matthews, J. L., Bartels, N., Elahee … More

Matthews, J. L., Bartels, N., Elahee Doomun, S. N., Davy, S. K., De Souza, D. P. Gas Chromatography-Mass Spectrometry-Based Targeted Metabolomics of Hard Coral Samples. J. Vis. Exp. (200), e65628, doi:10.3791/65628 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter