Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi Analizi için Mercan Holobiont, Ayrılmış Mercan Konak Dokusu ve Symbiodiniaceae Hücrelerinden Metabolitlerin Hazırlanması

Liyofilize holobionttan hücre içi metabolitleri çıkarmak için, liyofilize holobiont’a dahili standartlara sahip 400 mikrolitre% 100 soğuk metanol ekleyin. Daha sonra 10 miligram asitle yıkanmış cam boncuk ekleyin ve tüpü önceden soğutulmuş bir boncuk değirmenine yerleştirin. Üç dakika boyunca 50 hertz’de yerleştirin.

Lizizden sonra, 600 mikrolitre soğuk metanol ekleyin ve bir dakika boyunca girdap yapın. Tüpü 30 dakika boyunca dört santigrat derecede bir döner çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Ayrılmış liyofilize simbiyodiniaca hücrelerinden metabolitleri çıkarmak için, kurutulmuş simbiyodiniaca hücrelerine iç standartlara sahip 200 mikrolitre soğuk metanol ekleyin.

Daha sonra asitle yıkanmış cam boncukları ekleyin ve tüpü 50 hertz’de önceden soğutulmuş bir boncuk değirmeni ekine yerleştirin. Üç dakika sonra, 800 mikrolitre metanol ekleyin ve 30 saniye boyunca girdap yapın. Ayrılmış liyofilize konakçı dokudan metabolit ekstraksiyonu için, kurutulmuş konakçı malzemeye dahili standartlar içeren bir mililitre soğuk metanol ekleyin ve 20 saniye boyunca girdap yapın.

Sonra tüpü 30 dakika boyunca dört santigrat derecede sonikasyon için yüzen bir tüp tutucuya yerleştirin. Metabolit ekstraktının saflaştırılması için, tüm numuneleri 3000G’de dört santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı, peleti bozmadan dikkatlice iki mililitrelik yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Peletin bir mililitresinde %50 soğuk metanol içinde tekrar süspanse edin ve bir dakika boyunca kuvvetlice girdap yapın. Tekrar santrifüjleyin, ardından süpernatan polar ekstraktları aynı numuneden yarı polar ekstraktlarla toplayın ve bir araya getirin. Çökeltileri gidermek için havuzlanmış ekstraktları 16, 100G’de 15 dakika santrifüjleyin.

Analiz için, her bir ekstraktın 50 mikrolitresini bir cam parçaya ayırın ve 30 santigrat derecede 30 dakika boyunca bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak konsantre edin. GCMS analizi, bir dizi amino asit, organik asit, karbonhidrat, yağ asidi ve steril dahil olmak üzere tüm tedavilerde 107 açıklamalı metabolit ortaya çıkardı. K, kümelemenin üç farklı örnek kümesini tanımladığı anlamına gelir.

Holobiont örnekleri, ayrılmış konakçı ve simbiyont fraksiyonları arasında orta düzeydeydi. K, küme dağılımları, paralel koordinatlar ve metabolit nispi bolluğundaki ısı haritası görselleştirmesi anlamına gelse de, holobiont profilinin konakçı fraksiyon profiline daha yakından eşleştiğini, hem konakçı hem de simbiyont profillerinden önemli ölçüde farklı olduğunu gösterdi. Konakçı ve simbiyont profilleri, konakçı ve simbiyont fraksiyonları arasında önemli ölçüde farklı olan 100 ayrı metabolit ile birbirinden önemli ölçüde farklıydı.