Mikroarray'ler kullanarak tRNA Aminoacylation (Şarj) Seviyeler genom Analizi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, TRNA şarj seviyelerindeki göreceli değişiklikleri belirlemektir. Bu, TRNA'yı bozulmamış şarj seviyeleri ile izole etmek için tedaviden önce ve sonra RNA'yı düşük bir pH'da izole ederek elde edilir. İkinci adım olarak, RNA, bağıl yük seviyelerinin belirlenmesine izin veren bir iyodat başına oksidasyon işlemine tabi tutulur.

Daha sonra numuneleri bir floresan oligonükleotide bağlayın ve A-T-R-N-A'ya bağlı ligasyon seviyelerindeki değişiklikleri ölçmek için bir mikrodizi üzerinde hibritleştirin, şarj sonuçları elde edilir. CHO genomik seviyesi, TRNA mikroarray teknolojisine dayalı olarak TRNA şarjındaki değişiklikler. Merhaba, ben Chicago Üniversitesi Biyokimya ve Moleküler Biyoloji Bölümü'ndeki DRT Pan laboratuvarından John Zai.

Bugün size genomik düzeyde yük TRNA'yı izole etmek ve ölçmek için bir prosedür göstereceğim. Bunu, laboratuvarımızdaki stres etkeni kelime oyunları sırasında TNA şarjındaki değişiklikleri ölçmek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

TRNA'ya toplam yükü izole etmek için, hücreleri bir masa üstü santrifüjde 30 mikrogram toplam RNA peleti üretmesi gereken en az 30 OD 600 maya hücresine eşdeğer bir şekilde büyüterek başlayın. Hücreleri bir lizis tampon çözeltisinde yeniden süspanse edin. Eşit hacimde sodyum asetat, doymuş fenil kloroform ve 30 saniye girdap ekleyin, ardından en az 30 saniye buzlanma uygulayın.

Girdaplama ve küp küp doğramayı iki kez daha tekrarlayın. Numuneyi 18.600 RFC'de dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Daha sonra sulu tabakayı çıkarın ve ikinci ekstraksiyondan sonra başka bir asetat doymuş fenil kloroform ekstraksiyonu gerçekleştirin.

Dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 18.600 RFC'de 2.7 x hacim etanol ve santrifüj ekleyerek RNA'yı çökeltin. Resus, RNA peletlerini lizis tampon çözeltisi içinde askıya alır ve ardından ikinci kez etanol ile çökeltir. Son olarak, sonraki tedavi için RNA'yı 10 milimolar tamponlu asetat ve bir milimolar EDTA içeren bir çözelti içinde yeniden süspanse edin.

Numune, eksi 80 santigrat derecede yaklaşık iki hafta daha uzun süre stabil bir şekilde saklanabilir. Bazı yüklü TNA'lar, S3 veya SCI beş floresan oligonükleotid etiketleriyle etiketlenmeden önce desilatasyona başlayacağından depolama önerilmez. Toplam TRNA, nispi yük seviyelerinin belirlenmesine izin veren bir parya gün oksidasyon işlemine tabi tutulur, bu da toplam RNA'nın her bir eko irna standardının 0.066 mikromolar ve 100 milimolar tamponlu asetat ile karıştırılması, 50 milimolar sodyum par IID tarihi varlığında 50 milimolar sodyum par IID tarihi için oksitlenmeyecek kontrol TRNA numunesi için sodyum par IID tarihi yerine 50 milimolar sodyum klorür kullanın.

Reaksiyonları 30 dakika sonra oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, 100 milimolara glikoz ekleyerek ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe ederek reaksiyonu söndürün. Reaksiyon söndürüldükten sonra, numunelerden kalan sodyum proratı çıkarmak için bir G 25 döndürme sütunu kullanarak bir tampon değişimi gerçekleştirin. 133 milimolar sodyum klorür nihai konsantrasyonuna 66 milimolar ve 2.7 x hacim etanol nihai konsantrasyonuna tamponlu asetat ekleyerek numuneleri çökeltin.

Daha sonra, tRNA örneklerini Resus ile izole edin, 50 milimolar tris HCL'de süspanse edin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra, eşit hacimde 50 milimolar tamponlu asetat ve 100 milimolar sodyum klorür ekleyerek reaksiyonu nötralize edin, 2.7 x hacim etanol ile çökeltin. RNA peletini mikrolitre başına yaklaşık bir mikrogram suda yeniden süspanse edin.

Kontrol ve oksitlenmiş numuneler, agaroz jeller üzerinde çalıştırılarak RNA kalitesi açısından kontrol edildikten sonra, TRNA'ya floresan oligo etiketleri yapıştırmak için floresan etiketlemeye devam edebiliriz. Mikrolitre de RNA başına 0.1 mikrogramı, oligonükleotid ligaz tamponu içeren dört mikromolar SI üç veya SI beş ile birleştirin %15 DMSO, mikrolitre başına 0.5 birim T dört DNA ligaz ve maya ekzo fosfataz 16 santigrat derecede 16 saatten fazla inkübe edin Ligasyondan sonra, numuneleri dört hacim potasyum asetat ve potasyum klorür ile karıştırın, ve daha sonra eşit hacimde fenil kloroform ile ekstrakte edin, sulu fazın ekstraksiyonunu takiben RNA preparatlarını etanol ile çökeltin. Son olarak, bağlanmamış oligonükleotidleri uzaklaştırmak için hibridizasyon yağı, mikrodizi slaytları ve damıtılmış sudan önce RNA peletlerini suda mikrolitre başına yaklaşık 0.1 mikrograma kadar askıya

Daha sonra, S3 veya SCI beş etiketli numuneyi 140 mikrolitre hibridizasyon tamponu somon sperm DNA'sı ile mililitre başına 140 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona ve poli A'yı mililitre başına yedi D mikrogramlık bir nihai konsantrasyona birleştirin, otomatik bir dizi hibridizleyici üzerinde bir hibridizasyon programı çalıştırın. TRNA çalışması için otomatik bir hibridizasyon makinesinin kullanılmasını şiddetle tavsiye ederiz, çünkü manuel hibridizasyon yüksek arka plan üretir. Hibridizasyon programı tamamlandığında, 50 mililitrelik konik bir tüpte üç ila beş dakika boyunca hafifçe çalkalayarak slaytları üç yıkama solüsyonu ile manuel olarak yıkayın.

Slaytları alüminyum folyo ile önceden sarılmış tüplerde en az iki kez yıkayın. En iyi sonuçlar için slaytları düşük hızda beş ila 10 dakika santrifüjleyerek kurutun. Slaytlar kuruduktan hemen sonra taranmalıdır.

Slaytlar, görüntü kalitesinde gözle görülür bir bozulma olmadan iki ila üç kez taranabilir, uygun şekilde izole edilmiş bir toplam RNA örneğinin temsili sonuçları ve analizi burada gösterilmektedir. Bu numune, %1 agro jeller üzerinde çalıştırıldığında tespit edilebilir protein veya fenol kontaminasyonu olmayan, ikiye yakın bir OD iki 60 ila OD iki 80 oranı ile çok temiz bir spektruma sahiptir. Hem oksitlenmiş hem de kontrol numuneleri, organizmalar arasında değişen diğer olası nükleik asit bantları ile güçlü bir TNA bandı göstermelidir.

Bir numune diğer numunelerden belirgin şekilde daha zayıfsa veya bulaşma gözlenirse, numuneler mikrodiziler için kullanılmamalıdır. Mikrodiziler, en zayıf TRNA probundan daha düşük bir büyüklük sırası olan çok düşük bir arka plana sahip olmalıdır. Bu prosedürü yaparken TRNA'nın nispi şarj seviyelerini nasıl izole edeceğinizi ve belirleyeceğinizi size az önce gösterdim.

Özellikle oksidasyon ve dilatasyon adımları sırasında reaktiflerinizi nükleazlardan uzak tutmayı unutmamak önemlidir. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.