Name: Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarrayler Kullanımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 29 min 41 s
Description: Öğrenin, bakteriyel gen ifadesi analizini mikroarray kullanarak gerçekleştirmeyi. Dolaylı etiketleme yöntemiyle mutant ve vahşi tip örnekleri karşılaştırarak farklı gen düzenlemelerini belirleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ters Transcriptase Reaksiyon 70-80 ° C ve 42 ° C ısıtma bloğu açın Su banyoları da bu adımda kullanılabilir. Isıtma bloklar kullanılıyorsa, ısı tekdüze böylece biraz su koyun. <ol><li> Astar tepki <ol><li> RNA 3 mg alın </li><li> 13 ul RNaz ücretsiz su ile ses seviyesini ayarlayın. </li><li> Rastgele hexamer primerler (2mg/mL) 2.5 ul ekle </li></ol></li><li> İyice karıştırın ve 8 dakika 70-80 ° C&#39;de inkübe edin. Daha sonra, 5 dakika buz koyun. </li><li> : RT kokteyl hazırlayın (14.5 ul / RXN) <table border="0"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Hacim </td></tr><tr><td> 5X İlk Strand tampon </td><td> 6 ul </td></tr><tr><td> 0.1 M DTT </td><td> 3 ul </td></tr><tr><td> 25X aminoallyl dNTP karışımı </td><td> 1.2 ul </td></tr><tr><td> Üst Simge II RT (200U/μl) </td><td> 2.3 ul </td></tr><tr><td> Su </td><td> 2.0 ul </td></tr></tbody></table> * N reaksiyonlar için tükendi sağlamak için kokteyl n 0,5 alikotları Master Mix hazırlamak. </li><li> Soğutmalı reaksiyonlar 14.5 ul ekleyin. </li><li> Mix (vorteks) ve 42 ° C&#39;de 3-4 saat inkübe </li><li> Gerekirse örnekleri -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> Hidroliz RNA <ol><li> Her bir örnek için, 1 N NaOH 3 ul ve 0,5 M EDTA 0.6 ul ekleyin. (Final conc.s = 100 mM NaOH, 10mM EDTA) </li><li> Mix ve 65 ° C&#39;de 10 dakika için. </li><li> Nötralize 33.6 ul 1M Hepes ekleyerek, pH = 7.0 (son kons .= 500mm Hepes) </li><li> Örnekleri, gerekirse, -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> Reaksiyon Arıtma: adi aa-dUTP kaldırılması ve serbest aminler Not: Bu arıtma protokolü Qiagen QIAquick PCRpurification kiti protokol değiştirilmiş. Qiagen tamponlar Cy boya kaplin reaksiyonu ile rekabet ücretsiz aminler içerdiğinden fosfat yıkama ve yıkama tamponları Qiagen sağlanan tamponlar yerine. Mini hazırlık kiti sütunları da kullanılabilir. <ol><li> 300 ul (veya 5X reaksiyon hacmi = 336 ul) tampon PB (Qiagen temin) ile cDNA reaksiyon karışımı ve QIAquick sütun transfer. </li><li> 2 ml toplama tüpü sütun (Qiagen temin) koyun ve 1 dakika için ~ 13.000 rpm&#39;de santrifüj. Boş toplama tüpü. </li><li> Yıkamak için, sütun ve 1 dakika için ~ 13.000 rpm&#39;de santrifüj 750 ul fosfat yıkama tamponu (değil Qiagen) ekleyebilirsiniz. </li><li> Toplama tüpüne boşaltın ve 750 ul yıkama ve santrifüj basamağı tekrarlayın. </li><li> Toplama tüpüne boşaltın ve sütun maksimum hızda bir ek 1 dakika santrifüj. </li><li> Yeni bir 1.5 mL mikrofuge&#39;de tüp sütun aktarın ve 30 ul fosfat elüsyon tampon dikkatlice ekleyin. (Çözelti hazırlama bölümüne bakınız) </li><li> 1 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Için ~ 1 dakika 13.000 rpm&#39;de santrifüj Zehir. </li><li> Zehir adımları yineleyerek 6-8 ikinci kez aynı tüpe (30 ul fosfat elution tampon başka bir). Son elüsyon hacmi ~ 60 ul olmalıdır. </li><li> CDNA miktarı bu aşamada sayısal olabilir: ng cDNA = (seyreltme faktörü) (OD260) (37) (toplam hacmi sütun yıkandı,) </li><li> 45 vac hız Kuru örnek ° C </li><li> Gerekirse örnekleri -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> Boya Ester Cy aa-cDNA Kaplin <ol><li> Yeniden süspanse 10 ul 50 mM Na-bikarbonat, pH = 9.0 gerekirse cDNA aminoallyl etiketli. (Bu tampon her iki hafta taze yapılmalıdır) </li><li> Karanlık bir yerde çalışmak, uygun Cy boya bir tüp prob ekleyin. Pipetleyin yukarı ve aşağı birkaç kez boya tekrar süspansiyon. </li><li> 1 saat reaksiyon oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin. (Kuluçka iki saat kadar gidebilir) </li></ol> Reaksiyon Arıtma II: Kuplajsız boya kaldırılması <ol><li> Reaksiyon için 35 ul 100 mM NaOAc pH 5.2 ekleyin. Iyice karıştırınız. </li><li> 250 ul ekleme (veya 5X reaksiyon hacmi = 225 ul) Buffer her bir örnek ve yukarı ve aşağı pipetleme karışım PB (Qiagen temin) </li><li> 2 ml toplama tüpüne bir QIAquick spin kolon (Qiagen temin) yerleştirin, sütun örnek uygulamak ve 1 dakika için ~ 13.000 santrifüj. Boş toplama tüpü. </li><li> Yıkamak için, 1 dakika için ~ 13.000 kolon ve santrifüj 0.75 ml Tampon PE (Qiagen temin) ekleyin. </li><li> 4. adımı yineleyin. </li><li> Boş toplama tüpü ve ek olarak 1 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj sütun. </li><li> Dikkatlice yerleştirin temiz bir 1.5 mL mikrofuge&#39;de tüp, sütun ve sütun membran merkezine 30 ul Tampon EB (Qiagen temin) ekleyin. </li><li> 1 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Için ~ 1 dakika 13.000 rpm&#39;de santrifüj Zehir. </li><li> Ikinci kez tekrar aynı tüpe Zehiradımları 7-9. Son yıkandı, hacmi ~ 60 ul olmalıdır. </li></ol> Etiketleme Reaksiyon Analizi CDNA miktarı ve etiket, bu aşamada sayısal olabilir: <ul><li> OD 260, 550 ve 650 (Boş sudur.) Nanodrop mikroarray programı kullanın ölçün. </li><li> Boyalar dahil edilmesi ve aşağıda verilen denklemler ile pmol DNA ve boya / nük oranı pmol hesaplayın: pmol nükleotidler = [OD260 * hacmi (mcL) * 37 ng / mcL * 1000 pg / ng / 324,5 pg / pmol </li></ul> Not: 1 OD260 = cDNA için 37 ng / ml; bir dNTP 324,5 pg / pmol ortalama molekül ağırlığı) pmol Cy3 = OD550 * hacmi (mcL) / 0.15 pmol Cy5 = OD650 * hacmi (mcL) / 0.25 nükleotidler / boya oranı = pmol pmol / cDNA Cy boya Nanodrop kullanıyorsanız, zaten her boya için ul / pmol verir. Sadece toplam pmol boya birleştirmek için hacim itibariyle bu sayıyı çarpmak gerekir. Not: boya dahil edilmesi ve örnek başına, 20&#39;den az nükleotidler / boya molekülleri bir oran&gt; 150-200 pmol döllemeler için en uygunudur . <ul><li> Örnekleri koyu -20 ° C&#39;de saklanabilir. <ul><li> Birlikte melezleşmiştir probları birleştirin ve 42 speedvac kuru ° C </li><li> Örnekler HYB için hazır olana kadar -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ul></li></ul> Pre-HYB slaytlar <ol><li> 3-5 dakika temiz bir kırmızı slayt tutucuya yerleştirin slayt yüzü aşağı RT üzerine 100 ml su </li><li> Birkaç saniye için 100 ° C ısıtma bloğu yüzü yukarı yerleştirerek slayt kuru Snap - yoğunlaşma kaybolmaya izlemek </li><li> 250 mJoules UV çapraz bağ slayt (UV çapraz bağlayıcı 2500 girin) </li><li> Önceden ısıtılmış 42 ° C su daldırma Hidrat slaytlar. RT 700 RPM 5 dk Spin. </li><li> Gerekirse en az 45 dakika önceden ısıtılmış ön-HYB (5XSSC,% 1 BSA,% 0.1 SDS) içeren 50ml Coplin kavanoza inkübe slaytlar @ 42 ° C ve inkübasyon uzun gidebilirsiniz. 50 ml-HYB ön tamponu: 12.5 ml 20x SSC, 10 ml% 5 BSA, 0.5 ml% 10 SDS, 27 ml su </li><li> Dip önceden ısıtılmış su (42 ° C) slaytlar ve HYB ön tampon kaldırmak için bir kaç dakika ajitasyon. </li><li> Isopropanol durulayın ve 700 rpm, oda sıcaklığında, kuru 5 dakika döndürün. </li></ol> Hibridizasyon için numunelerin hazırlanması <ol><li> Su içinde süspanse edin prob (birimler aşağıda verilmiştir) <table border="0"><tbody><tr><td> Toplam vol. = 30μl </td><td> Toplam vol. = 35μl </td><td> Toplam vol .= 40μl </td><td></td></tr><tr><td> 19.8 ul su </td><td> 23.55 ul su </td><td> 27.2 ul su </td><td> </td></tr><tr><td> 1.5 ul </td><td> 1.5 ul </td><td> 1.5 ul </td><td> 10 mg / ml somon sperm DNA (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1.2 ul </td><td> 1.2 ul </td><td> 1.2 ul </td><td> 12.5 mg / ml tRNA </td></tr><tr><td> 4,5 ul </td><td> 5.25 ul </td><td> 6 ul </td><td> 20XSSC (3X son) </td></tr><tr><td> 3 ul </td><td> Ul 3.5 </td><td> 4 ul </td><td> 1% SDS </td></tr></tbody></table> Not: reaktiflerin ek sırası önemlidir. Ana karışımı hazırlamak etmeyin. </li><li> 5 dakika kaynatılır, sonra 14.000 rpm&#39;de 5 dakika dönerler. 2 dakika süreyle oda sıcaklığında soğutun. </li></ol> Melezleme <ol><li> Her kenar ve orta hibridizasyon odasının kuyulardan 3X DGM&#39;nin 10-12 ul ekleyin. </li><li> Slayt uygun bir alana, temiz bir kaldırıcı kayma ekleyin ve hafifçe hibridizasyon çözüm yük (30 -40 ul). Kapak kayma iki kenarında ekstra örnek olmalıdır. </li><li> Odasında slayt yerleştirin. Bir gecede 65 ° C su banyosunda vida ve yer sıkın. Su banyosu alt doğrudan odasına koymayın. Her şeyi yerinde tutmak için en üst odasının üstünde bir blok yerleştirin. Işığa duyarlı örnekleri korumak için su banyosu kapağı tutun. </li></ol> HYB yıkar <ol><li> Aşağıdaki tamponlar hazırlayın: <ul><li> 1X SSC,% 0.05 SDS </li><li> 0.06 X SSC </li></ul></li><li> Inkübasyon mührünü kırmak hibridizasyon odasına sonra. Lamel rahatsız etmemek için özen slayt odasından çıkarın. </li><li> Lamelleri kaldırmak için, sıcak 1X SSC, çanak alt bakan% 0.05 SDS yıkama tamponu lamel içeren bir tabak içinde batığın slaytlar. Lamel slayt yan tarafına hareket ettirerek kapalı düşecek. </li><li> Lamel kaldırıldıktan sonra slayt, taze bir banyo, sıcak 1XSSCm% 0.05 SDS bir rafa koyun. Birkaç dakika için kışkırtıcılık </li><li> 0.06 X SSC banyo slaytlar artı rafa aktarın. </li><li> Slaytları başka bir ba aktarın0.06 X SSC, taze hamamı yerleştirmeden önce mümkün olduğunca çok SDS içeren tampon kaldırmak için bir kağıt havlu üzerine slayt blot, taze raf içeren th. </li><li> Birkaç dakika için slaytlar çalkalayın. </li><li> 5 dak 700 rpm için oda sıcaklığında hemen Spin, daha sonra slayt tarama için hazır. Taranan kadar karanlıkta saklayın. </li></ol>

<ol><li>Hasseman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIGR+Aminoallyl+Labeling+of+RNA+for%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays+%26+TIGR+Microarray+Labeled+Probe+Hybridization%22%5BJournal%5D)">TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for.</a> Microarrays & TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization. , Forthcoming.</li>
<li>Gilbert,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIGR+Microbial+RNA+Aminoallyl+Labeling+for+Microarrays+%26+Hybridization+of+probed+labels%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays & Hybridization of probed labels.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Hedge,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concise+guide+to+cDNA+Microarray+analysis-II%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A concise guide to cDNA Microarray analysis-II.</a> , Forthcoming.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>AA-dUTP</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0410</td><td>5-(3-aminoallyl)-2&amp;rsquo;deoksiuridin-5&amp;rsquo;-trifosfat</td></tr><tr><td>dNTP</td><td></td><td>Amersham</td><td>27-2035-01</td><td>100 mM dNTP Set PCR sınıfı</td></tr><tr><td>Rastgele hekzamer primerler</td><td></td><td>Amersham</td><td>27-2166-01</td><td>3mg/mL</td></tr><tr><td>SuperScript III RT</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>80800444</td><td>200U/&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>CyDye&amp;#8482;</td><td></td><td>Amersham</td><td>RPN5661</td><td>Etiketleme Sonrası Reaktif Boya Paketi</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td></td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>PCR Saflaştırma kiti</td></tr><tr><td>1 M K2HPO4</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KPO4</td><td>Tampon</td><td></td><td></td><td>1M Fosfat tamponu (KPO4, pH 8.5-8.7) hazırlamak için şunları birleştirin: 9.5 mL 1M K2HPO4 ve 0.5 ml 1M KH2PO4</td></tr><tr><td>Fosfat yıkama tamponu</td><td>Tampon</td><td></td><td></td><td>100 mL Fosfat yıkama tamponu (5 mM KPO4, pH 8.0, %80 EtOH) için şunları karıştırın: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ su + 84.25 mL %95 etanol. Yıkama tamponu hafif bulanık olacaktır.** ÖNEMLİ: Fosfat yıkama tamponu günlük olarak hazırlanmalıdır.</td></tr><tr><td>Fosfat elüsyon tamponu</td><td>Tampon</td><td></td><td></td><td>1 M KPO4, pH 8.5'in steril su ile 4 mM'e seyreltilmesi</td></tr><tr><td>Sodyum Karbonat Tamponu</td><td></td><td></td><td></td><td>(Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. 4.2 g NaHCO3'ü 80 mL steril su içinde çözün ve pH'ı 10 N NaOH ile 9.0'a ayarlayın; hacmi steril su ile 100 mL'ye tamamlayın. Boya eşleşme reaksiyonu için 50 mM'lik bir çözelti hazırlamak üzere su ile 1:10 oranında seyreltin. Not: Karbonat tamponunun bileşimi zamanla değişir; iki haftada bir veya ayda bir taze olarak hazırlayın.</td></tr></tbody></table>

bakteriyel gen İfadesi analizi mikroarray&#39;ler kullanımı

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarray&#39;ler Kullanımı

Merhaba, benim adım Ena ve laboratuvarımızda rutin olarak gen ekspresyon profillemesi yapıyoruz. Bu tekniği, met ve wild type arasındaki diferansiyel regüle edilen genleri izlemek için kullanıyoruz. Bugün elimde wild type ve met RNA örnekleri var ve önce hepsine cDNA sentezi yapacağız.İndirekt etiketleme yöntemlerini kullanıyoruz ve bu tekniğin avantajı, direkt etiketlemede meydana gelebilecek göz yanılmasını önlemektir. Bunu gerçekleştirmek için RNA örneklerimiz mevcuttur ve toplam 13 µL hacimde 3 µg RNA elde etmeyi tercih ediyoruz. Ayrıca, karışımlarımıza 2,5 µg random hexamer ekliyoruz.RNA'nın doğasını korumak için örneği sekiz dakika boyunca 75 °C'de inkübe edeceğiz. Şimdi ise; AM L-D-L-D-U-T-P kontinu karışımı, ters transkriptaz tamponu ve ayrıca ET TT içeren ters transkripsiyon kokteylini ekleyip numuneyi vorteksleyeceğiz. Ardından örneği dört saat boyunca 42 °C'de inkübe edeceğiz. Dört saatin sonunda örnekleri dışarı çıkaracağız.Şu an tüpte cDNA ve RNA karışımına sahibiz. Yapmak istediğimiz şey, sodyum hidroksit ve EDTA ekleyerek RNA'yı hidroksilleyerek parçalamaktır; sodyum hidroksit için son konsantrasyon 100 mM, EBt için ise son konsantrasyon 5 mM olmalıdır.Şimdi örnekler

bacterial-gene-expression-analysis-using-microarrays

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz çevre mRNA cDNA üreten için bir yöntem sunuyoruz. Genel olarak, toplam RNA ilk çevreden toplanan, rRNA seçici kaldırılır mRNA seçici yükseltilir ve zenginleştirilmiş mRNA havuzu sentezlenen cDNA dizisi. Kurtarılan dizileri ifade genleri tanımlamak için standart biyoinformatik teknikleri kullanarak açıklamalı olabilir.

Çevre transkriptomik kullanarak Deniz Mikrobiyal Toplulukları Gen İfade Analizi

Gen mikroarray'ler genom düzeyinde gen ekspresyonu güçlü araçlardır. Bu teknoloji, gelişim biyolojisi ve toksikoloji de dahil olmak üzere biyolojik disiplinlerin çeşitli uygulaması vardır. Bu video zebrafish için kapsamlı bir oligonükleotid mikroarray platformunu kullanarak küresel gen ekspresyon analizi için detaylı bir protokoldür.

Zebra balığı Oligonükleotid Mikroarray Platformu kullanarak Global Gen İfadesi Analizi

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

Mikroarray analizi genetik ekspresyon profillerini belirlemek için...

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Sistematik, büyük ölçekli sentetik gen (bir gen ya da gen-epistasis) etkileşim ekranlar genetik ve fazlalık yolu çapraz konuşma keşfetmek için kullanılabilir. Burada, yüksek-throughput kantitatif sentetik genetik dizi tarama teknolojisi tarif eSGA biz epistatik ilişkileri durulaştırmada ve genetik etkileşim ağları keşfetmek için geliştirilen...

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Bu el yazması, DNA mikrodizileri tarafından sağlanan en son teknolojinin kullanımını açıklamaktadır. Mikrodiziler, belirli bir koşul altında bakterilerde meydana gelen transkriptomik değişikliklere genel bir bakış sağlar. Ayrıca, şirket içinde geliştirilen uygun yazılım paketleri kullanılarak büyük miktarda verinin analiz edilebilmesinin kolaylığını vurguluyoruz.

Bakteriyel Transkriptom Analizi Vaka çalışması için A Hızlı ve Güvenilir Boru Hattı: Serin bağımlı Gen Yönetmelik<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Bir enfeksiyon sırasında patojen gen ekspresyon profili oluşturmak için hızlı, hassas ve tekrarlanabilir bir protokol geliştirdik.

Dijital Çizgi-kodlama Platform&#39;u kullanarak bulaşmasını Mikroplar Gen İfadesi profil

Burada açıklanan bakteri gen ekspresyonu hayvan dokularında hücresel düzeyde analiz etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem ve doku ortamındaki bakteriyel bir nüfus enfeksiyon sırasında içinde meydana gelen fenotipik çeşitlilik eğitimi için bir kaynak sağlar.

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Bu prosedür, birincil fare kemik iliği hematopoetik hücre kültürleri kurmak ve transfeksiyon Gene Verici MXCell elektroporasyon sistemini kullanarak takip nasıl açıklamaktadır.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. Part 1 3.

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 1

Öğrenin, bakteriyel gen ifadesi analizini mikroarray kullanarak gerçekleştirmeyi. Dolaylı etiketleme yöntemiyle mutant ve vahşi tip örnekleri karşılaştırarak farklı gen düzenlemelerini belirleyin.

Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarray'ler Kullanımı

Daha fazla video keşfet