Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarray'ler Kullanımı

Merhaba, benim adım Ena ve laboratuvarda rutin olarak gen ekspresyon profili çıkarıyoruz. Ve bu tekniği, metamfetamin ve vahşi tip arasındaki diferansiyel düzenlenmiş genleri izlemek için kullanıyoruz. Ve bugün elimde vahşi bir tür ve metamfetamin RNA örnekleri var ve hepimiz önce C yapıyoruz.

Dolaylı bir etiketleme yöntemi kullanıyoruz ve bu tekniğin avantajı, doğrudan etiketlemede oluşabilecek göz yanlılığını önlemektir. Ve bunu yapmak için RNA örneklerimiz var ve toplam hacmin 13 mikrolitresinde üç mikrogram RNA elde etmeyi seçiyoruz. Ve parklarımıza rastgele 2.5 mikro he ekliyoruz.

Ve sekiz dakika boyunca RNA'nın doğasına sahip olmak için numuneyi yedi beş derecede inkübe edeceğiz. Ve şimdi ekleyeceğiz, L-D-L-D-U-T-P sürekli karışımı, ters transkriptaz tamponu ve ayrıca ET TT Big it down içeren ters transkripsiyon kokteyli ekleyeceğiz ve numuneyi dört saat boyunca 42 derecede inkübe edeceğiz. Bu yüzden dört saat sonra numuneleri çıkarıyoruz.

Ve şimdi tüpün içinde CDNA ve RNA karışımımız var. Ve yapmak istediğimiz şey, sodyum hidroksit ve EDTA ekleyerek hidroksit RNA yapmak ve sodyum hidroksit için son konsantrasyon yüz molar olmalıdır. Ve e BT için son konsantrasyon beş molar olmalıdır.

Ve şimdi numuneleri 65 derece su banyosunda 10 dakika inkübe edeceğiz. Böylece inkübasyon yapılır ve 500 molar'lık nihai konsantrasyona pH yedi yığın bir su ekleyerek numuneleri kullanacağız. Bu noktada numuneleri eksi 20'de saklayabilir veya temizlemeye devam edebilirsiniz.

CDNA'nın temizlenmesi için KaiGen PCR saflaştırma kitini kullanıyoruz. Ancak, Bush tamponu ve iyon tamponu serbest bırakma içerdiğinden, biz yapmıyoruz, kendi kader bush tamponumuzu ve kader iyon tamponumuzu hazırlıyoruz ve 300 litre PPI ekleyeceksiniz ve bu göleti yavaşça size aktaracağız, karışımı sütunlara aktaracağız Ve bir dakika boyunca en yüksek hızda döneceksiniz Ve izleyeceksiniz, Hazırladığımız tampon. Fosfat yıkama tamponu, 750 mikrolitre ekleyeceksiniz ve böylece bir tane daha ekleyeceksiniz.

Bu yüzden, tüm yatağı aldığımızdan emin olmak için tekrar döneceğiz. Ve bu tüpleri boş suçlu tüplerine aktaracağız. Ve 30 markör fo fosfat E tamponu ekleyeceğim, bu da pH 8.5'te dört dört molar potasyum fosfattır.

Ve burada sadece her şeyi sütunun ortasına eklediğinizden emin olmanız gerekiyor ve oda sıcaklığında bir dakika inkübe edeceksiniz. Bu yüzden tekrar bir dakika dönecek ve kuluçkaya yatırdığım veya yatak odasına aldığım 30 mikro sıfır tampon daha ekleyeceğim. Bu yüzden sütunu kaldırıyorum ve toplam 60 mikro veya CDA hacmimiz var.

CDNA'yı temizledikten sonra, eksi 20 derecede saklayabilirsiniz ve ayrıca kurutabilir ve daha sonra CDNA'yı geri bildirimde kurutabilmemiz için saklayabiliriz. Şimdi tüpte modifiye edilmiş kuru CDA'mız var. Ve yapacağımız şey, kuru numuneyi askıya almak.

Numuneyi pH dokuzda 10 tür 15 LAR bikarbonatta askıya alacağım. Ve bunu sadece bu adımda yukarı ve aşağı çekerek yapacağım, cDNA'yı yeniden canlandırmak çok önemli. Eh, şirketin işe tepki vermesi için, bu reaksiyon karanlık odada gerçekleşmelidir çünkü floresan etiketler kalıba duyarlıdır.

Ancak, bunları yaşam bilimlerinden seçmek ve onlar, bireysel paketler halinde geldiler. S beşin mor kapağı var ve üçüncü tarafın turuncu kapağı var ve ayrıca S beşi askıya alındığında Sion görünüyor ve Cary eflatun görünüyor. Karanlık odada yapacağım şey, bu numuneleri boya tüplerine aktaracağım, boyayı tekrar askıya alacağım ve onları elimdeki tüpe geri aktaracağım.

Ve sonra iki saat karanlıkta kuluçkaya yatıracağım, iki saatlik inkübasyondan sonra bu, pH 5.2'de 35 adet yüz milimolar sodyum asetat ekleyerek reaksiyonu durdurur. Ve bundan sonra benzer temizleme prosedürü ile temizledik. Ancak bu sefer Cajun tarafından sağlanan yıkama tamponu ve elüsyon tamponu kullanıyoruz.

Numuneyi koyduğunuz ve cihazı temizlemesi gereken yerleri tarif edebilirsiniz. Yani numunenizi veya karışımınızı şu anda yapabilirsiniz I To, Yani bu benim bilimkurgu etiketli örneğim ve burada gördüğümüz şey, CDA içeriğini gösteren OD iki 60 ve bilimkurgu için D birleşimini gösteren OD altı 50. Ve işte benim yan üç etiket örneğim.

Yine, altı konsantrasyonu ve beş 50 ölçü sitesi üç birleştirmeyi bükün. D şirketim verimli çalıştığı için örnekleri şimdi birleştireceğim, Bayan kısaca özledim. Ve şimdi geri bildirim kullanarak tekrar bir örnek yazacağız.

Tamam, slaytın izasyonu için, slaytı evrensel olarak suyun üzerine koyarak yeniden sulandıracağız ve bu da lekeleri daha büyük hale getirecek. Ve sonra bunu korumak için, sadece yüz santigrat derecede kuruyacağız ve daha sonra UV hibritize edeceğiz veya lekeleri slayta UV çapraz bağlayacağız ve sonra sahip olduğumuz yüksek tampon öncesi inkübe edeceğiz. Bu yüzden kaydırağı yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştiriyorum ama henüz suya değmiyor.

Ve beş dakika boyunca bu şekilde bekleyeceğiz. Ben, Yani bu kutu daha büyük görünüyor, koymadan öncekinden daha parlak olmalılar ve slaytı yüz derece koyarak kuruyacaksınız ve yoğuşmayı gözlemleyeceksiniz. Ve seninle çapraz bağlantı kuracağız.

Bu yüzden hidrasyon için, kaydırağı savaş öncesi suya daldıracağım. Ve bu gerçekten hızlı olmalı çünkü buradaki amaç, bağlantılı olmayan tüm noktalardan veya tüm oligolardan kurtulmak istemenizdir. Ve bu süreçte yavaş giderseniz, sadece noktalarınızda kuyruklar elde edersiniz.

Bu yüzden gerçekten hızlı yaptığınızdan emin olun ve uçuşunuzu sudan çıkarmadığınızdan ve 30 saniye boyunca Bu Şeyleri yapmadığınızdan emin olun ve hemen oda sıcaklığında beş dakika ve 700 hava pm fut yapın Bunu alın, bu slaytı sahip olduğumuz savaş öncesi boru istasyonu tamponuna sığdırdık Ve slaytı yavaşça kavanozun içine itiyoruz ve bunu 42 derecede inkübe edeceğiz. en az 45 dakika. Yani burada hibritleştirilecek kurutulmuş örneğimiz var. Bu yüzden önce Resus'u suda askıya alacağız.

Bu adımda, yukarı ve aşağı hareket ederek askıya alıyoruz ve numuneyi çok beyaz, beyaz maruz bırakmayın. Ve sonra birinin sperm DNA'sını 1.5 ekleyeceksiniz ve konsantrasyon mil başına 10 miligramdır. Ve TRNA'nın 1.2 pazarlamacısını ekleyeceksiniz.

Konsantrasyon başına 12.5 miligramdır, spesifik olmayan hidrografiyi bloke etmek için tRNA ve som sperm DNA'sı ekleriz. Ve 5.35 işaretleyici sıfır üç XSSC ekliyoruz, bu da üç x'in son konsantrasyonunu veriyor. Ve son olarak 3,5 mikrolitre% 1 SDS ekliyoruz.

Şimdi karışımı beş dakika kaynatacağız ve beş dakika boyunca en yüksek hızda döndüreceğiz ve bunu elde etmeye hazır olacak. Kaydırağımızı kuluçkaya yatırdığımızdan bu yana bir saat geçti ve şu anda su ve izopropanolüm var. Bu yüzden, SDS'den kurtulmak için önce slaytı suda çalkalayacağım ve ardından dza propanolünüzü yıkayacağım ve doğrudan standart göstergeye koyacağım.

Ve burada, kurumayı önlemek için ışığı çok fazla havaya maruz bırakmamaya dikkat edin. Bu yüzden doğrudan zarar istasyonu tamponundan suya giriyorum ve slaytı yıkıyoruz. Birkaç dakika, hareketin yanlara doğru değil, yalnızca yukarı ve aşağı olduğundan emin olun.

Ayrıca sürgünün suyun üzerinde olmadığından emin olun ve hemen izopropanole aktaracağız. Ve yine birkaç dakika burada kalıyor. Ve sayfanız Lütfen sayfanıza oda sıcaklığında beş dakika cevap verebilir mi?

700 R.Soğuk. Bu yüzden slaytımız da hibritleştirilmeye hazırdır ve onu veri yolundan korumak için bir slayt kutusunda saklamanız daha iyi olur. Bu yüzden hasat istasyonu için kaldırma veya kayma kullanacağız.

Kapak fişi üzerinde beyaz şeritler vardır ve bunlar bir miktar kaldırma sağlar ve numunemizin kapak fişi ile slayt arasına girmesi için biraz alan sağlar. Ve onu etanol ile temizliyorum Ve sonra tel indiriyor Ve sadece test parçacığı olmadığından emin olun. Bu yüzden önce baskı alanını işaretlediğimiz şablon slaytımızı alacağız ve üzerine hazırladığımız slaytı koyacağız ve mükemmel bir şekilde hizalandıklarından emin olacağız.

Mükemmel şekilde hizalandıklarından emin olun. Ve şeritlerin yan tarafta olduğundan, onunla yüzleşeceğimizden emin olmanız gerekir. Bu yüzden görmesi gerçekten zor, ama görebildiğinizden emin olun.

Ve çizgiler slaytların yanlarında olmalıdır. Ve örneğimizi yanlardan yükleyeceğiz. Az miktarda numune alıyorum, bu yüzden önce 15 mikrolitre alıyorum ve kapak fişinin köşesinden yüklemeye başlıyorum.

Ve yavaşça onu içeri çekerdim ve tüm alanı kaplamak için kenar boyunca hareket ederdim. Bu aşamada herhangi bir baloncuk oluşturmamak çok önemlidir ve herhangi bir kurumayı önlemek için 15 migrator daha alıp slaytların yanına uygularım. Böylece numunemiz hazır ve lamı hibritleşirken nemlendirmek için mikro kanallara sahip slaytlarımızı ve önceliklendirme odalarımızı kuluçkaya yatıracaksınız.

Ve slaytın altı köşesine üç XSSC'den 10 pazarlamacı ekleyeceğiz. Odada, üzgünüm, her köşede altı yer vardı ve her iki tarafta, Kapak kaymasının kaymaması için sürgüyü gerçekten nazikçe aktardığınızdan emin olun. Ve sürgüyü sağ tarafı yukarı bakacak şekilde koyduğunuzda, istifleneceğini, koyduğunuz suya yapışacağını ve kapağı taktığını göreceksiniz ve vidaların sıkı olduğundan emin olun.

Konuşma odasını 65 derecelik su torbasında kuluçkaya yatıracağız, ancak doğrudan dibe koymak istemiyoruz. Bu yüzden aşırı ısı transferini önlemek için bir çeşit plastik bariyer koyduk. Ve izasyon odamızı nazikçe yerleştiriyoruz ve herhangi bir yer değiştirmeyi önlemek için bir çeşit ağırlık da koyabilirsiniz.

Ve bu inkübasyon gece boyunca, tipik olarak 10 ila 12 saat arasında sürecektir. Bu nedenle, dilimin yıkanması için yüzde 0,05 SDS'ye sahip bir XSSC kullanıyoruz. Bu, kapak fişini çıkarmak için olacak.

Ve bu ilk adımı yıkamak için olacak. Ve sahip olduğumuz tüm SDS boyunca yalnızca %0.06 altı XSC ile iki adım daha yapacağız. Bu yüzden hepimiz konuşmayı mahvediyoruz ve slaytları alıyoruz ve yüzü aşağı bakacak şekilde çanta kabına koyuyoruz.

Ve onu iki yana sallayacağız ve kapak kaymasının yavaşça düşeceğini göreceğiz. Pekala, ve, Ve biz sadece XES içeren başka bir yıkama tamponuna geçeceğiz. Bir dakika boyunca yemek yersin.

Oh altı XSSC'ye gitmeye geçin. Ve sadece tüm FDS'den kurtulduğumuzdan emin olmak için, bir kez daha tekrarlayacağız. Kuruması için santrifüj, 700 RP'de beş dakika boyunca oda sıcaklığında kaldı. Işığa duyarlı olduğu için bu slaydı slayt kutusunda tutarsınız.

İşte bu slayt tarayıcı ve buraya slayt koyacaksınız, burada küçük bir alan, slaydı yüzü aşağı bakacak şekilde koyun, doğru etiketleyin ve, Ve ikinci slaytta sadece taramak istediğiniz alanı tanımlayacaksınız. Ve slaytlarımızda sadece bu alanı ele alacaksınız. Slaytlarımızı yazdırmak için 16 pin kullanıyoruz.

Yani her blok bir pime karşılık gelir ve slaytlarımız 8.000'den fazla nokta içerir. Ve biz vi renk genomunu iki kez temsil ediyoruz çünkü yaklaşık 4.000 gen var. Yani kullandığımız her oligo için iki noktamız var.

Ve eğer bunlar yakınlaşırsa, bu özel deneyde göreceksiniz, transkripsiyon düzenleyici mutantları vahşi tiple karşılaştırırız ve mutant, kırmızı renk veren bilimkurgu ile etiketlenir. Ve yabani tür, yeşil renk veren üçüncü bölgeydi. Yani bu lekeler gibi kırmızı görünen herhangi bir şey, mutanttaki transkriptlerin bolluğunun vahşi tipten daha yüksek olduğunu gösterir.

Bu yüzden kırmızı veya kırmızı tonlarında görünürler ve yeşil görünen herhangi bir şey, transkriptin bolluğunun vahşi tipte mutantlara kıyasla daha yüksek olduğunu gösterir. Ve sarı görünen herhangi bir nokta, bu transkriptin hem mutant hem de vahşi tipte eşit derecede mevcut olduğunu gösterir. Yani üst üste bindiklerinde, bu amalar gibi sarı görünürler.