Name: Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarrayler Kullanımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 29 min 41 s
Description: Öğrenin, bakteriyel gen ifadesi analizini mikroarray kullanarak gerçekleştirmeyi. Dolaylı etiketleme yöntemiyle mutant ve vahşi tip örnekleri karşılaştırarak farklı gen düzenlemelerini belirleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ters Transcriptase Reaksiyon 70-80 ° C ve 42 ° C ısıtma bloğu açın Su banyoları da bu adımda kullanılabilir. Isıtma bloklar kullanılıyorsa, ısı tekdüze böylece biraz su koyun. <ol><li> Astar tepki <ol><li> RNA 3 mg alın </li><li> 13 ul RNaz ücretsiz su ile ses seviyesini ayarlayın. </li><li> Rastgele hexamer primerler (2mg/mL) 2.5 ul ekle </li></ol></li><li> İyice karıştırın ve 8 dakika 70-80 ° C&#39;de inkübe edin. Daha sonra, 5 dakika buz koyun. </li><li> : RT kokteyl hazırlayın (14.5 ul / RXN) <table border="0"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Hacim </td></tr><tr><td> 5X İlk Strand tampon </td><td> 6 ul </td></tr><tr><td> 0.1 M DTT </td><td> 3 ul </td></tr><tr><td> 25X aminoallyl dNTP karışımı </td><td> 1.2 ul </td></tr><tr><td> Üst Simge II RT (200U/μl) </td><td> 2.3 ul </td></tr><tr><td> Su </td><td> 2.0 ul </td></tr></tbody></table> * N reaksiyonlar için tükendi sağlamak için kokteyl n 0,5 alikotları Master Mix hazırlamak. </li><li> Soğutmalı reaksiyonlar 14.5 ul ekleyin. </li><li> Mix (vorteks) ve 42 ° C&#39;de 3-4 saat inkübe </li><li> Gerekirse örnekleri -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> Hidroliz RNA <ol><li> Her bir örnek için, 1 N NaOH 3 ul ve 0,5 M EDTA 0.6 ul ekleyin. (Final conc.s = 100 mM NaOH, 10mM EDTA) </li><li> Mix ve 65 ° C&#39;de 10 dakika için. </li><li> Nötralize 33.6 ul 1M Hepes ekleyerek, pH = 7.0 (son kons .= 500mm Hepes) </li><li> Örnekleri, gerekirse, -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> Reaksiyon Arıtma: adi aa-dUTP kaldırılması ve serbest aminler Not: Bu arıtma protokolü Qiagen QIAquick PCRpurification kiti protokol değiştirilmiş. Qiagen tamponlar Cy boya kaplin reaksiyonu ile rekabet ücretsiz aminler içerdiğinden fosfat yıkama ve yıkama tamponları Qiagen sağlanan tamponlar yerine. Mini hazırlık kiti sütunları da kullanılabilir. <ol><li> 300 ul (veya 5X reaksiyon hacmi = 336 ul) tampon PB (Qiagen temin) ile cDNA reaksiyon karışımı ve QIAquick sütun transfer. </li><li> 2 ml toplama tüpü sütun (Qiagen temin) koyun ve 1 dakika için ~ 13.000 rpm&#39;de santrifüj. Boş toplama tüpü. </li><li> Yıkamak için, sütun ve 1 dakika için ~ 13.000 rpm&#39;de santrifüj 750 ul fosfat yıkama tamponu (değil Qiagen) ekleyebilirsiniz. </li><li> Toplama tüpüne boşaltın ve 750 ul yıkama ve santrifüj basamağı tekrarlayın. </li><li> Toplama tüpüne boşaltın ve sütun maksimum hızda bir ek 1 dakika santrifüj. </li><li> Yeni bir 1.5 mL mikrofuge&#39;de tüp sütun aktarın ve 30 ul fosfat elüsyon tampon dikkatlice ekleyin. (Çözelti hazırlama bölümüne bakınız) </li><li> 1 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Için ~ 1 dakika 13.000 rpm&#39;de santrifüj Zehir. </li><li> Zehir adımları yineleyerek 6-8 ikinci kez aynı tüpe (30 ul fosfat elution tampon başka bir). Son elüsyon hacmi ~ 60 ul olmalıdır. </li><li> CDNA miktarı bu aşamada sayısal olabilir: ng cDNA = (seyreltme faktörü) (OD260) (37) (toplam hacmi sütun yıkandı,) </li><li> 45 vac hız Kuru örnek ° C </li><li> Gerekirse örnekleri -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> Boya Ester Cy aa-cDNA Kaplin <ol><li> Yeniden süspanse 10 ul 50 mM Na-bikarbonat, pH = 9.0 gerekirse cDNA aminoallyl etiketli. (Bu tampon her iki hafta taze yapılmalıdır) </li><li> Karanlık bir yerde çalışmak, uygun Cy boya bir tüp prob ekleyin. Pipetleyin yukarı ve aşağı birkaç kez boya tekrar süspansiyon. </li><li> 1 saat reaksiyon oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin. (Kuluçka iki saat kadar gidebilir) </li></ol> Reaksiyon Arıtma II: Kuplajsız boya kaldırılması <ol><li> Reaksiyon için 35 ul 100 mM NaOAc pH 5.2 ekleyin. Iyice karıştırınız. </li><li> 250 ul ekleme (veya 5X reaksiyon hacmi = 225 ul) Buffer her bir örnek ve yukarı ve aşağı pipetleme karışım PB (Qiagen temin) </li><li> 2 ml toplama tüpüne bir QIAquick spin kolon (Qiagen temin) yerleştirin, sütun örnek uygulamak ve 1 dakika için ~ 13.000 santrifüj. Boş toplama tüpü. </li><li> Yıkamak için, 1 dakika için ~ 13.000 kolon ve santrifüj 0.75 ml Tampon PE (Qiagen temin) ekleyin. </li><li> 4. adımı yineleyin. </li><li> Boş toplama tüpü ve ek olarak 1 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj sütun. </li><li> Dikkatlice yerleştirin temiz bir 1.5 mL mikrofuge&#39;de tüp, sütun ve sütun membran merkezine 30 ul Tampon EB (Qiagen temin) ekleyin. </li><li> 1 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Için ~ 1 dakika 13.000 rpm&#39;de santrifüj Zehir. </li><li> Ikinci kez tekrar aynı tüpe Zehiradımları 7-9. Son yıkandı, hacmi ~ 60 ul olmalıdır. </li></ol> Etiketleme Reaksiyon Analizi CDNA miktarı ve etiket, bu aşamada sayısal olabilir: <ul><li> OD 260, 550 ve 650 (Boş sudur.) Nanodrop mikroarray programı kullanın ölçün. </li><li> Boyalar dahil edilmesi ve aşağıda verilen denklemler ile pmol DNA ve boya / nük oranı pmol hesaplayın: pmol nükleotidler = [OD260 * hacmi (mcL) * 37 ng / mcL * 1000 pg / ng / 324,5 pg / pmol </li></ul> Not: 1 OD260 = cDNA için 37 ng / ml; bir dNTP 324,5 pg / pmol ortalama molekül ağırlığı) pmol Cy3 = OD550 * hacmi (mcL) / 0.15 pmol Cy5 = OD650 * hacmi (mcL) / 0.25 nükleotidler / boya oranı = pmol pmol / cDNA Cy boya Nanodrop kullanıyorsanız, zaten her boya için ul / pmol verir. Sadece toplam pmol boya birleştirmek için hacim itibariyle bu sayıyı çarpmak gerekir. Not: boya dahil edilmesi ve örnek başına, 20&#39;den az nükleotidler / boya molekülleri bir oran&gt; 150-200 pmol döllemeler için en uygunudur . <ul><li> Örnekleri koyu -20 ° C&#39;de saklanabilir. <ul><li> Birlikte melezleşmiştir probları birleştirin ve 42 speedvac kuru ° C </li><li> Örnekler HYB için hazır olana kadar -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ul></li></ul> Pre-HYB slaytlar <ol><li> 3-5 dakika temiz bir kırmızı slayt tutucuya yerleştirin slayt yüzü aşağı RT üzerine 100 ml su </li><li> Birkaç saniye için 100 ° C ısıtma bloğu yüzü yukarı yerleştirerek slayt kuru Snap - yoğunlaşma kaybolmaya izlemek </li><li> 250 mJoules UV çapraz bağ slayt (UV çapraz bağlayıcı 2500 girin) </li><li> Önceden ısıtılmış 42 ° C su daldırma Hidrat slaytlar. RT 700 RPM 5 dk Spin. </li><li> Gerekirse en az 45 dakika önceden ısıtılmış ön-HYB (5XSSC,% 1 BSA,% 0.1 SDS) içeren 50ml Coplin kavanoza inkübe slaytlar @ 42 ° C ve inkübasyon uzun gidebilirsiniz. 50 ml-HYB ön tamponu: 12.5 ml 20x SSC, 10 ml% 5 BSA, 0.5 ml% 10 SDS, 27 ml su </li><li> Dip önceden ısıtılmış su (42 ° C) slaytlar ve HYB ön tampon kaldırmak için bir kaç dakika ajitasyon. </li><li> Isopropanol durulayın ve 700 rpm, oda sıcaklığında, kuru 5 dakika döndürün. </li></ol> Hibridizasyon için numunelerin hazırlanması <ol><li> Su içinde süspanse edin prob (birimler aşağıda verilmiştir) <table border="0"><tbody><tr><td> Toplam vol. = 30μl </td><td> Toplam vol. = 35μl </td><td> Toplam vol .= 40μl </td><td></td></tr><tr><td> 19.8 ul su </td><td> 23.55 ul su </td><td> 27.2 ul su </td><td> </td></tr><tr><td> 1.5 ul </td><td> 1.5 ul </td><td> 1.5 ul </td><td> 10 mg / ml somon sperm DNA (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1.2 ul </td><td> 1.2 ul </td><td> 1.2 ul </td><td> 12.5 mg / ml tRNA </td></tr><tr><td> 4,5 ul </td><td> 5.25 ul </td><td> 6 ul </td><td> 20XSSC (3X son) </td></tr><tr><td> 3 ul </td><td> Ul 3.5 </td><td> 4 ul </td><td> 1% SDS </td></tr></tbody></table> Not: reaktiflerin ek sırası önemlidir. Ana karışımı hazırlamak etmeyin. </li><li> 5 dakika kaynatılır, sonra 14.000 rpm&#39;de 5 dakika dönerler. 2 dakika süreyle oda sıcaklığında soğutun. </li></ol> Melezleme <ol><li> Her kenar ve orta hibridizasyon odasının kuyulardan 3X DGM&#39;nin 10-12 ul ekleyin. </li><li> Slayt uygun bir alana, temiz bir kaldırıcı kayma ekleyin ve hafifçe hibridizasyon çözüm yük (30 -40 ul). Kapak kayma iki kenarında ekstra örnek olmalıdır. </li><li> Odasında slayt yerleştirin. Bir gecede 65 ° C su banyosunda vida ve yer sıkın. Su banyosu alt doğrudan odasına koymayın. Her şeyi yerinde tutmak için en üst odasının üstünde bir blok yerleştirin. Işığa duyarlı örnekleri korumak için su banyosu kapağı tutun. </li></ol> HYB yıkar <ol><li> Aşağıdaki tamponlar hazırlayın: <ul><li> 1X SSC,% 0.05 SDS </li><li> 0.06 X SSC </li></ul></li><li> Inkübasyon mührünü kırmak hibridizasyon odasına sonra. Lamel rahatsız etmemek için özen slayt odasından çıkarın. </li><li> Lamelleri kaldırmak için, sıcak 1X SSC, çanak alt bakan% 0.05 SDS yıkama tamponu lamel içeren bir tabak içinde batığın slaytlar. Lamel slayt yan tarafına hareket ettirerek kapalı düşecek. </li><li> Lamel kaldırıldıktan sonra slayt, taze bir banyo, sıcak 1XSSCm% 0.05 SDS bir rafa koyun. Birkaç dakika için kışkırtıcılık </li><li> 0.06 X SSC banyo slaytlar artı rafa aktarın. </li><li> Slaytları başka bir ba aktarın0.06 X SSC, taze hamamı yerleştirmeden önce mümkün olduğunca çok SDS içeren tampon kaldırmak için bir kağıt havlu üzerine slayt blot, taze raf içeren th. </li><li> Birkaç dakika için slaytlar çalkalayın. </li><li> 5 dak 700 rpm için oda sıcaklığında hemen Spin, daha sonra slayt tarama için hazır. Taranan kadar karanlıkta saklayın. </li></ol>

<ol><li>Hasseman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIGR+Aminoallyl+Labeling+of+RNA+for%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays+%26+TIGR+Microarray+Labeled+Probe+Hybridization%22%5BJournal%5D)">TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for.</a> Microarrays & TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization. , Forthcoming.</li>
<li>Gilbert,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIGR+Microbial+RNA+Aminoallyl+Labeling+for+Microarrays+%26+Hybridization+of+probed+labels%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays & Hybridization of probed labels.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Hedge,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concise+guide+to+cDNA+Microarray+analysis-II%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A concise guide to cDNA Microarray analysis-II.</a> , Forthcoming.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>AA-dUTP</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0410</td><td>5-(3-aminoallyl)-2&amp;rsquo;deoksiuridin-5&amp;rsquo;-trifosfat</td></tr><tr><td>dNTP</td><td></td><td>Amersham</td><td>27-2035-01</td><td>100 mM dNTP Set PCR sınıfı</td></tr><tr><td>Rastgele hekzamer primerler</td><td></td><td>Amersham</td><td>27-2166-01</td><td>3mg/mL</td></tr><tr><td>SuperScript III RT</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>80800444</td><td>200U/&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>CyDye&amp;#8482;</td><td></td><td>Amersham</td><td>RPN5661</td><td>Etiketleme Sonrası Reaktif Boya Paketi</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td></td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>PCR Saflaştırma kiti</td></tr><tr><td>1 M K2HPO4</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KPO4</td><td>Tampon</td><td></td><td></td><td>1M Fosfat tamponu (KPO4, pH 8.5-8.7) hazırlamak için şunları birleştirin: 9.5 mL 1M K2HPO4 ve 0.5 ml 1M KH2PO4</td></tr><tr><td>Fosfat yıkama tamponu</td><td>Tampon</td><td></td><td></td><td>100 mL Fosfat yıkama tamponu (5 mM KPO4, pH 8.0, %80 EtOH) için şunları karıştırın: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ su + 84.25 mL %95 etanol. Yıkama tamponu hafif bulanık olacaktır.** ÖNEMLİ: Fosfat yıkama tamponu günlük olarak hazırlanmalıdır.</td></tr><tr><td>Fosfat elüsyon tamponu</td><td>Tampon</td><td></td><td></td><td>1 M KPO4, pH 8.5'in steril su ile 4 mM'e seyreltilmesi</td></tr><tr><td>Sodyum Karbonat Tamponu</td><td></td><td></td><td></td><td>(Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. 4.2 g NaHCO3'ü 80 mL steril su içinde çözün ve pH'ı 10 N NaOH ile 9.0'a ayarlayın; hacmi steril su ile 100 mL'ye tamamlayın. Boya eşleşme reaksiyonu için 50 mM'lik bir çözelti hazırlamak üzere su ile 1:10 oranında seyreltin. Not: Karbonat tamponunun bileşimi zamanla değişir; iki haftada bir veya ayda bir taze olarak hazırlayın.</td></tr></tbody></table>

bakteriyel gen İfadesi analizi mikroarray&#39;ler kullanımı

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarray&#39;ler Kullanımı

Merhaba, benim adım Ena ve laboratuvarımızda rutin olarak gen ekspresyon profillemesi yapıyoruz. Bu tekniği, met ve wild type arasındaki diferansiyel regüle edilen genleri izlemek için kullanıyoruz. Bugün elimde wild type ve met RNA örnekleri var ve önce hepsine cDNA sentezi yapacağız.İndirekt etiketleme yöntemlerini kullanıyoruz ve bu tekniğin avantajı, direkt etiketlemede meydana gelebilecek göz yanılmasını önlemektir. Bunu gerçekleştirmek için RNA örneklerimiz mevcuttur ve toplam 13 µL hacimde 3 µg RNA elde etmeyi tercih ediyoruz. Ayrıca, karışımlarımıza 2,5 µg random hexamer ekliyoruz.RNA'nın doğasını korumak için örneği sekiz dakika boyunca 75 °C'de inkübe edeceğiz. Şimdi ise; AM L-D-L-D-U-T-P kontinu karışımı, ters transkriptaz tamponu ve ayrıca ET TT içeren ters transkripsiyon kokteylini ekleyip numuneyi vorteksleyeceğiz. Ardından örneği dört saat boyunca 42 °C'de inkübe edeceğiz. Dört saatin sonunda örnekleri dışarı çıkaracağız.Şu an tüpte cDNA ve RNA karışımına sahibiz. Yapmak istediğimiz şey, sodyum hidroksit ve EDTA ekleyerek RNA'yı hidroksilleyerek parçalamaktır; sodyum hidroksit için son konsantrasyon 100 mM, EBt için ise son konsantrasyon 5 mM olmalıdır.Şimdi örnekleri 10 dakika boyunca 65 °C su banyosunda inkübe edeceğiz. İnkübasyon işlemi tamamlandı ve örnekleri, final konsantrasyonu 500 molar olacak şekilde pH 7 HEPES tamponu ekleyerek kullanacağız. Bu aşamada örnekleri -20 °C'de saklayabilir veya temizleme işlemine devam edebilirsiniz.cDNA temizliği için KaiGen PCR saflaştırma kiti kullanıyoruz. Ancak, Bush tamponu ve iyon tamponu ferritin içerdiğinden, kendi fosfatlı Bush tamponumuzu ve fosfatlı iyon tamponumuzu hazırlıyoruz; 300 µL PPI ekleyip bunu yavaşça pipetleyoruz, ardından karışımı kolonlara aktarıyoruz. En yüksek hızda bir dakika boyunca santrifüj ediyoruz ve ardından hazırladığımız fosfatlı yıkama tamponundan 750 µL ekliyoruz ve aynı işlemi bir kez daha tekrarlıyoruz.Tüm hücrelerin çöktüğünden emin olmak için örnekleri tekrar santrifüjleyeceğiz. Ardından bu tüpleri boş eppendorf tüplerine aktaracağız. Bunlara, pH 8.5'te 4 molar potasyum fosfat içeren 30 µL fosfat E tamponu ekleyeceğim.Burada sadece her şeyi kolonun merkezine eklediğinizden emin olmanız gerekir ve oda sıcaklığında bir dakika boyunca inkübe edeceksiniz. Böylece cihaz bir dakika daha dönecektir ve ben 30 µL daha buffer ekleyeceğim; oda sıcaklığında inkübe ediyorum. Ardından kolonu çıkarıyorum ve toplam 60 µL CDA hacmine sahip oluyoruz.cDNA'yı temizledikten sonra, -20 °C'de saklayabilirsiniz; ayrıca kurutup öyle de saklayabiliriz, yani cDNA'yı vakumla kurutabiliriz. Şu anda tüpte, modifiye edilmiş kuru cDNA bulunuyor. Şimdi yapacağım işlem, kuru örneği süspansiyona almaktır.Numuneyi pH 9'da 15 mM bikarbonat içeren 10 µL çözeltide süspansiyon haline getireceğim. Bunu, bu aşamada sadece pipetleme yaparak gerçekleştireceğim; cDNA'yı iyice resüspand etmek çok önemlidir. Bağlama reaksiyonunun çalışması için, floresan etiketler ışığa duyarlı olduğundan bu reaksiyon karanlık odada gerçekleştirilmelidir.Ancak, bunlar yaşam bilimlerinden seçildiği için ayrı paketlerde geldiler. S5 mor kapaklı, S3 ise turuncu kapaklıdır; ayrıca S5 süspanse edildiğinde siyan, Cary ise macenta renginde görünür. Bu nedenle, karanlık odada yapacağım işlem, bu örnekleri boya tüplerine aktarmak, boyayı yeniden süspanse etmek ve ardından örnekleri kendi tüplerine geri aktarmaktır.Ardından iki saat boyunca karanlıkta inkübe edeceğim; iki saatlik inkübasyonun ardından, pH 5,2'de 100 millimolar sodyum asetatın 35 µL'sini ekleyerek reaksiyonu durduruyorum. Bundan sonra, benzer bir temizleme prosedürü ile temizleme işlemini gerçekleştiriyoruz. Ancak bu kez, kit ile birlikte sağlanan yıkama tamponu ve elüsyon tamponunu kullanıyoruz.Numuneyi yerleştirdiğiniz yerleri tanımlayabilir ve ardından cihazı temizlemelisiniz. Şu an numunenizi veya karışımınızı ekleyebilirsiniz. Bu, scifi etiketli numunem ve burada gördüğümüz, CDA içeriğini gösteren OD 260 ile scifi için D inklüzasyonunu gösteren OD 650 değerleridir. Burada ise side 3 etiketli numunem yer alıyor.Tekrar, altı konsantrasyonu ve beş 50 ölçümünü üç numaralı bölgeye dahil ederek döndürün. D korporasyonum verimli çalıştığından, örnekleri şimdi birleştireceğim; ardından bunları kısaca karıştırın. Ve şimdi, geri bildirimi kullanarak yeniden bir örnek hazırlayacağız.Tamam, lamın hazırlanması için, lamı suyun üzerine yerleştirerek yeniden hidrasyon sağlayacağız ve bu işlem lekelerin büyümesini sağlayacaktır. Ardından bunu korumak için 100 °C'de hızlıca kurutacağız ve daha sonra lekeleri lama UV hibridizasyonu veya UV çapraz bağlama yöntemiyle sabitleyeceğiz ve ardından elimizdeki ön hibridizasyon tamponunda inkübe edeceğiz. Şimdi lamı yüzü aşağıya bakacak şekilde yerleştiriyorum, ancak henüz suya temas etmiyor.Ve bu şekilde beş dakika bekleyeceğiz. Bu kutu daha büyük görünüyor, eklediğinizden önce olduğundan daha parlak görünmeliler ve lamı 100 derecede tutarak hızlıca kurutacak ve yoğuşmayı gözlemleyeceksiniz. Ve ardından youi ile çapraz bağlama yapacağız.Hidrasyon için, lamı önceden ısıtılmış suya daldıracağım. Bu işlem oldukça hızlı olmalıdır çünkü buradaki amaç, bağlanmamış olan tüm lekelerden veya lekeler üzerindeki tüm oligolardan kurtulmaktır. Bu işlemde yavaş davranırsanız, lekelerinizde kuyruklanmalar oluşacaktır.Bu işlemi gerçekten hızlı yaptığınızdan ve lamı sudan çıkarmadığınızdan emin olun. Bu işlemi 30 saniye boyunca gerçekleştirin ve ardından hemen oda sıcaklığında beş dakika boyunca 700 rpm'de santrifüjleyin. Şimdi bu lamı, önceden hazırladığımız tampon çözeltisi içeren kaba yerleştirelim. Lamı yavaşça kavanoza itiyoruz ve burada 42 °C'de en az 45 dakika boyunca inkübe edeceğiz. Buradale hibritlecek olan kurutulmuş örneğimiz mevcut. Önce bunu su içerisinde yeniden süspande edeceğiz.Bu adımda, pipetle yukarı-aşağı hareketler yaparak sadece resüspansiyon işlemini gerçekleştirin ve numuneyi çok fazla ışığa maruz bırakmayın. Ardından, 10 mg/mL konsantrasyonda 1,5 µL sperm DNA'sı ekleyin. Son olarak 1,2 µM tRNA ekleyin.Konsantrasyon 12,5 mg/mL'dir, spesifik olmayan hibridizasyonu engellemek için tRNA ve som sperm DNA'sı ekleriz. Ardından, nihai konsantrasyonu 3x yapacak şekilde 5,35 µL 30x SSC ekleriz. Son olarak 3,5 µL %1 SDS ekleriz.Şimdi karışımı beş dakika boyunca kaynatacağız ve ardından beş dakika boyunca en yüksek hızda santrifüj edeceğiz; böylece işlem tamamlanmış olacak. Slaytımızı inkübe edeli bir saat oldu ve şu an elimde su ve izopropanol var. Bu nedenle, önce SDS'den kurtulmak için slaytı suda çalkalayacağım, ardından izopropanol ile yıkayıp doğrudan standart gauge içine yerleştireceğim.Burada, kurumayı önlemek için lamın havayla çok fazla temas etmemesine dikkat edin. Bu nedenle, doğrudan harm station tampon çözeltisinden suya geçiyorum ve lamı yıkıyorum. Birkaç dakika boyunca, hareketin yanlara doğru değil, sadece yukarı ve aşağı olduğundan emin olun.Ayrıca lamın su seviyesinin üzerinde kalmadığından emin olun ve lamı hemen izopropanole aktarın. Lam burada birkaç dakika daha bekletilir. Ardından, lütfen sayfanızı oda sıcaklığında beş dakika boyunca bekletin.700 R.Cool. Böylece lamımız hibridizasyona hazır hale geldi; lamı tozdan korumak için bir lam kutusunda saklamanız daha iyi olacaktır. Hasat istasyonu için lift veya slip kullanacağız.Kapak camının üzerinde beyaz şeritler bulunmaktadır; bunlar bir miktar yükselti sağlayarak numunenin kapak camı ile lam arasına girmesi için boşluk oluşturacaktır. Burayı etanol ile temizliyorum ve ardından yerleştirip herhangi bir toz partikülü kalmadığından emin oluyorum. İlk olarak, baskı alanının işaretli olduğu şablon lamımızı alacağız ve üzerine hazırladığımız lamı yerleştirerek mükemmel şekilde hizalandıklarından emin olacağız.Kusursuz bir şekilde hizalandıklarından emin olun. Ayrıca, aşağıya bakacak olan tarafta şeritlerin olduğundan emin olmanız gerekir. Görmesi gerçekten zordur, ancak görebildiğinizden emin olun.Şeritler slaytların yanlarında olmalıdır. Örneğimizi yanlardan yükleyeceğiz. Küçük miktarlarda örnek alıyorum, bu yüzden önce 15 µL alıyorum ve yüklemeye lamelin köşesinden başlıyorum.Yavaşça içeri doğru çekeceğim ve tüm alanı kapsamak için kenar boyunca ilerleyeceğim. Bu aşamada, herhangi bir hava kabarcığı oluşmamasına dikkat etmek çok önemlidir; kurumasını önlemek için lamların kenarlarına 15 µL daha migratör uyguluyorum. Böylece örneğimiz hazır hale gelir ve lamları, hibridizasyon sırasında lamı nemlendirmek için mikro kanallara sahip olan önceliklendirme odalarında inkübe edersiniz.Slaydın altı köşesine 10 µL 3X SSC ekleyeceğiz. Kamarada altı yer vardı, pardon, her köşede ve her kenarda. Lamı, lamellenin kaymaması için gerçekten nazikçe taşıdığınızdan emin olun. Lamı düz bir şekilde yerleştirdiğinizde, koyduğunuz suya yapıştığını göreceksiniz ve lamelini kapatın. Vidaların sıkı olduğundan emin olun.Konversasyon odasını 65 °C'lik su banyosunda inkübe edeceğiz, ancak onu doğrudan tabana yerleştirmek istemiyoruz. Bu nedenle, aşırı ısı transferini önlemek için bir plastik bariyer koyuyoruz. Ardından, iyonizasyon odasını nazikçe yerleştiriyoruz ve herhangi bir yer değiştirmeyi önlemek için üzerine bir ağırlık da koyabilirsiniz.Bu inkübasyon gece boyunca, tipik olarak 10 ila 12 saat arasında sürecektir. Kesitlerin yıkama işlemi için %0,05 SDS içeren 1X SSC kullanıyoruz. Bu işlem, lameli çıkarmak içindir.Bu, yıkamanın ilk adımı olacak. Ardından, elimizdeki tüm SDS'leri kullanarak sadece %0,06 altı XSC ile iki adım daha gerçekleştireceğiz. Hazırlıkları tamamlayıp lamları alıyoruz ve yüzeyleri aşağı bakacak şekilde kapların içine yerleştiriyoruz.Ardından yanlara doğru sallayacağız ve lamelin yavaşça düştüğünü göreceğiz. Tamam, ve şimdi, XES içeren diğer yıkama tamponuna aktaracağız. Bir dakika boyunca bekleyin.06 XSSC'ye geçin. Tüm FDS'leri temizlediğimizden emin olmak için işlemi bir kez daha tekrarlayacağız. Oda sıcaklığında, 700 RP'de beş dakika boyunca kurutma santrifüjü yapın. Işığa duyarlı olduğu için bu lamı lam kutusunda saklayın.Bu, lam tarayıcıdır ve lamı buraya, tam şu küçük boşluğa, etiket kısmı size bakacak şekilde yüzü aşağıya gelecek şekilde yerleştireceksiniz. İkinci lamda ise sadece taramak istediğiniz alanı belirleyeceksiniz. Lamlarımızdaki bu alanı seçeceksiniz. Lamlarımızı basmak için 16 pin kullandık.Böylece her blok bir pine karşılık gelir ve lamlarımız 8.000'den fazla spot içerir. Yaklaşık 4.000 gen olduğu için vi renk genomunu iki kez temsil ediyoruz. Dolayısıyla, kullandığımız her oligo için iki spotumuz bulunmaktadır.Ve burayı yakınlaştırırsanız, bu özel deneyde transkripsiyon regülatör mutantlarını yaban tip ile karşılaştırdığımızı görürsünüz; mutantlar kırmızı renk veren scifi ile işaretlenmiştir. Yaban tip ise yeşil renk veren site üç ile işaretlenmiştir. Dolayısıyla, bu noktalar gibi kırmızı görünen her şey, mutanttaki transkript bolluğunun yaban tipten daha yüksek olduğunu göstermektedir.Böylece bunlar kırmızı veya kırmızının tonlarında görünürler ve yeşil görünen her şey, transkript bolluğunun mutant ile karşılaştırıldığında vahşi tipte daha yüksek olduğunu gösterir. Sarı görünen herhangi bir nokta ise, söz konusu transkriptin hem mutantta hem de vahşi tipte eşit miktarda bulunduğunu belirtir. Dolayısıyla, üst üste geldiklerinde, bu noktalar gibi sarı görünürler.

bacterial-gene-expression-analysis-using-microarrays

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz çevre mRNA cDNA üreten için bir yöntem sunuyoruz. Genel olarak, toplam RNA ilk çevreden toplanan, rRNA seçici kaldırılır mRNA seçici yükseltilir ve zenginleştirilmiş mRNA havuzu sentezlenen cDNA dizisi. Kurtarılan dizileri ifade genleri tanımlamak için standart biyoinformatik teknikleri kullanarak açıklamalı olabilir.

Çevre transkriptomik kullanarak Deniz Mikrobiyal Toplulukları Gen İfade Analizi

Gen mikroarray'ler genom düzeyinde gen ekspresyonu güçlü araçlardır. Bu teknoloji, gelişim biyolojisi ve toksikoloji de dahil olmak üzere biyolojik disiplinlerin çeşitli uygulaması vardır. Bu video zebrafish için kapsamlı bir oligonükleotid mikroarray platformunu kullanarak küresel gen ekspresyon analizi için detaylı bir protokoldür.

Zebra balığı Oligonükleotid Mikroarray Platformu kullanarak Global Gen İfadesi Analizi

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

Mikroarray analizi genetik ekspresyon profillerini belirlemek için...

Genetik İfade Profilleri Belirlenmesi C. elegans Mikroarray ve Real-time PCR

Sistematik, büyük ölçekli sentetik gen (bir gen ya da gen-epistasis) etkileşim ekranlar genetik ve fazlalık yolu çapraz konuşma keşfetmek için kullanılabilir. Burada, yüksek-throughput kantitatif sentetik genetik dizi tarama teknolojisi tarif eSGA biz epistatik ilişkileri durulaştırmada ve genetik etkileşim ağları keşfetmek için geliştirilen...

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Bu el yazması, DNA mikrodizileri tarafından sağlanan en son teknolojinin kullanımını açıklamaktadır. Mikrodiziler, belirli bir koşul altında bakterilerde meydana gelen transkriptomik değişikliklere genel bir bakış sağlar. Ayrıca, şirket içinde geliştirilen uygun yazılım paketleri kullanılarak büyük miktarda verinin analiz edilebilmesinin kolaylığını vurguluyoruz.

Bakteriyel Transkriptom Analizi Vaka çalışması için A Hızlı ve Güvenilir Boru Hattı: Serin bağımlı Gen Yönetmelik<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Bir enfeksiyon sırasında patojen gen ekspresyon profili oluşturmak için hızlı, hassas ve tekrarlanabilir bir protokol geliştirdik.

Dijital Çizgi-kodlama Platform&#39;u kullanarak bulaşmasını Mikroplar Gen İfadesi profil

Burada açıklanan bakteri gen ekspresyonu hayvan dokularında hücresel düzeyde analiz etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem ve doku ortamındaki bakteriyel bir nüfus enfeksiyon sırasında içinde meydana gelen fenotipik çeşitlilik eğitimi için bir kaynak sağlar.

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Bu prosedür, birincil fare kemik iliği hematopoetik hücre kültürleri kurmak ve transfeksiyon Gene Verici MXCell elektroporasyon sistemini kullanarak takip nasıl açıklamaktadır.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. Part 1 3.

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 1

Öğrenin, bakteriyel gen ifadesi analizini mikroarray kullanarak gerçekleştirmeyi. Dolaylı etiketleme yöntemiyle mutant ve vahşi tip örnekleri karşılaştırarak farklı gen düzenlemelerini belirleyin.

Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarray'ler Kullanımı

Daha fazla video keşfet