Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Mikroskop aşamasına parçalanmış yumurta odaları ile bir kapak sapı yerleştirin. Mikroenjeksiyon için uygun gelişim aşamasında ve yönelimde bir yumurta odası bulun. Orta ila geç aşama yumurta odalarında büyük bir görünür oosit sarısı vardır ve doğru yönde olanlar enjeksiyon yönüne dik ön-arka eksenleri ile birliktedir.
Drosophila sinir hücreleri, yumurta odasının içinde, gelişmekte olan oosit içine doğumsal olarak türetilmiş besinleri ve biyomolekülleri biriktirmekten sorumlu 15 hücreden oluşan bir gruptur. Tutarlı enjeksiyon hacmi ve dışa doğru akış sağlamak için mikroenjektör sistemini uygun enjeksiyon ve kompanzasyon basıncına ayarlayın. Hücreler ve iğnenin aynı odak düzleminde olması için görüş alanına önceden yüklenmiş bir kılcal iğneyi dikkatlice getirin.
Kılcal damarın ucuna sıkışmış hava olmadığından ve çözeltinin sürekli bir akışı olduğundan emin olun. Daha sonra folikül hücrelerini hemşire hücrelerinden ayıran zara odaklanmak için hedefin Z pozisyonunu ayarlayın, iğneyi bir hemşire hücresine yerleştirin ve enjeksiyonu yapın.
Aşağıdaki protokol, drosophila hemşire hücrelerini canlı hücre görüntüleme için doğuma katkıda bulunan mRNA transkriptlerine karşı moleküler işaret olarak adlandırılan floresan oligonükleotid problarla mikroenjecting göstermektedir.
- Moleküler işaret mikroenjeksiyonu için, 40x yağ hedefini seçin ve parçalanmış yumurta odası ile bir kapak fişini mikroskop aşamasına monte edin. Orta ila geç gelişim aşamasında mikroenjeksiyon için uygun şekilde yönlendirilmiş bir yumurta odası bulun, ardından uygun enjeksiyon ve kompanzasyon basınçlarına sahip bir mikroenjektör kurun.
Mikromanipülatör joystick'ini kullanarak, bir mikroliter moleküler işaret çözeltisi ile yüklenmiş bir iğneyi yağ damlasına hafifçe küçümseyin. Ucu görüş alanının çevresine doğru odaklayın. İğne ucundaki havayı çıkarmak ve iğneden akış olduğundan emin olmak için temiz bir işlev gerçekleştirin ve iğneyi ev konumuna getirin.
Mikroenjected yumurta odasına odaklanın ve iğneyi yumurta odasının kenarına yakın bir noktaya getirin. Hedefin Z pozisyonunun ince bir ayarını yapın, böylece folikül hücrelerini hemşire hücrelerinden ayıran zar odaktadır.
- Tekrarlanabilir mikroenjeksiyon başarısını sağlamak için, iğnenin ucunu mikromanipülatörle odaklarken, folikül hücrelerini ayıran zara ve enjekte edilecek hemşire hücrelerine dikkatlice odaklanın.
- Tüm moleküler işaretler enjekte edildiğinde, iğneyi yavaşça çıkarın ve ev konumuna geri çek. Hedefi görüntü alımı için istenen büyütmeye değiştirin, ardından yeni amaç altındaki yumurta odasına odaklanın ve görüntü alımına başlayın.
