Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- İğne çekerek ince duvarlı cam kılcal damarlar çekerek konik enjeksiyon iğneleri hazırlayın. Bir iğneyi mikroskop altında tutun ve ucu kırın, açıklığın yetişkin sinek manikürünü gereğinden fazla yaralamadan delecek kadar büyük olduğundan emin olun. İğnenizi steril bir boya ve tuz tampon çözeltisi ile yükleyerek ve ardından bir sahne mikrometresinde bir damla mineral yağ üzerine atarak enjeksiyon hacmini ölçün. Atılan damlacığın çapını ölçmek için mikrometredeki ölçeği kullanın, bu da dağıtılan hacmi hesaplamak için kullanılabilir ve enjektörünüzü kalibre edin ayarları buna göre ayarlar.
İğneyi enjeksiyon çözeltinizle yükleyin ve bir enjeksiyon nozuluna monte edin. Sineklerinizi CO2 ile uyuşturun ve onları uyuşturacak bir CO2 sinek pedi üzerine yerleştirin. Sinekler deneyiniz için doğru yönde olduğunda, enjeksiyonlara devam edin. Örnek protokolde, yetişkin sineklere in vivo görüntüleme için floresin etiketli parçacıklar enjekte edeceğiz.
- İğne çekerek ince duvarlı cam kılcal damarları çektikten sonra, bir mikrometre kullanarak iğneyi mikroskop altında tutun ve ucu 100 mikrometre uç çapına kırmak için beş numaralı ince noktalı paslanmaz çelik cımbız kullanın. Her sineğe enjekte edilecek sıvı hacmini ölçmek için PBS'de steril %5 gıda renklendirmesine sahip bir kılcal iğne yükleyin ve sıvıyı 0,01 milimetrelik bir aşama mikrometrede bir damla mineral yağa dışarı atın.
Mililitre parçacık başına 10 mikrolitreyi küçük bir parafilm karesine dağıtın ve sıvıyı iğneye çekin. İğneyi enjektör nozuluna monte edin ve uyuşturulmuş sinekleri sinek pedi üzerinde belirlenen alan boyunca hizalayın, ventral tarafı yukarı, kafalar pedi ön tarafa doğru olacak şekilde. Şişeleri tezgahta ilgili alanlara yerleştirin ve toplam yaklaşık 10 nanolitre parçacık teslim etmek için 100 milisaniyelik beş sıvı pompası ile karnın üst köşesine sinekleri enjekte edin. Her bir sineği enjekte edilirken uygun şişeye aktarın. şişedeki zaman.
Ardından, % 0,4 Trypan Blue çözeltisi ile yeni bir iğne yükleyin ve pnömatik enjektörü 'kapılı' olarak ayarlayın, böylece sabit bir hava akışının sıvıyı iğneden dışarı itmeye izin verin. İlk enjeksiyondan 30 dakika sonra, karınlar dolana ve şişkin olana kadar her sinek karnına Trypan Blue enjekte edin. Sinekleri elektrik bandı ventral tarafı aşağı doğru olan mikroskop slaytlarına monte edin, kanatları banta sabitlemek için sineğin yanına itin. Sonra sineğin hareket etmeyeceğinden emin olmak için başı hafifçe bant içine itin.
