Encyclopedia of Experiments: Biology
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- लिपिड बूंदों की कल्पना करते समय, तटस्थ लिपिड के लिए इंट्रासेलुलर स्टोरेज ऑर्गेनेल्स, एक डिटर्जेंट समाधान जोड़कर शुरू करते हैं, जैसे कि ट्राइटन एक्स-100 युक्त, नमूने में। यह कीड़े की कोशिकाओं को पार कर जाएगा। इसके बाद, आइसोप्रोपैनॉल की उचित एकाग्रता में नमूना ठीक करें, उदाहरण के लिए 40%।
फिर, नमूने में नील लाल जोड़ें और इसे प्रकाश से बचाएं, क्योंकि डाई हल्के संवेदनशील है। निर्धारण डाई को पूरे जानवर में लिपिड बूंदों तक पहुंचने की अनुमति देता है नील लाल एक लिपोफिलिक डाई है जिसका फ्लोरेसेंस उत्सर्जन स्पेक्ट्रम स्थानीय लिपिड पर्यावरण के ध्रुवता पर निर्भर करता है।
जब फॉस्फोलिपिड्स जैसे ध्रुवीय लिपिड के संपर्क में आता है, तो नील लाल का उत्सर्जन स्पेक्ट्रम उच्च, लाल तरंगदैर्ध्य में होता है। जब लिपिड बूंदों के तटस्थ कोर में ट्राइसिलग्लिसिरोलॉल और स्टेरोल एस्टर जैसे बेअसर लिपिड के संपर्क में आते हैं, तो नील लाल का उत्सर्जन स्पेक्ट्रम निचले, पीले-सोने की तरंगदैर्ध्य में बदल जाता है।
इसलिए, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के हरे चैनल का उपयोग करें, जो पीले-सोने की तरंगदैर्ध्य उत्सर्जन को इकट्ठा करेगा, पूरे जानवर में लिपिड बूंदों के नील लाल धुंधला कल्पना करने के लिए। उदाहरण प्रोटोकॉल में, हम एक नील लाल धुंधला प्रक्रिया और निश्चित नमूनों में लिपिड बूंदों की इमेजिंग देखेंगे।
- नील लाल लिपिड धुंधला करने के लिए, नेमाटोड विकास माध्यम, या एनजीएम पर प्लेट कीड़े, देर से लॉग OP50 ई. कोलाई के साथ वरीयता प्राप्त है, और शुरुआती L4 चरण के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर कीड़े बढ़ें। PBST समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ कीड़े को धोएं और 1.5 मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब में कीड़े निलंबन को स्थानांतरित करें।
एक मिनट के लिए 560 बार गुरुत्वाकर्षण पर कीड़े को अपकेंद्रित्र करें, फिर सुपरनेट को हटा दें और पीबीएसटी वॉश को तब तक दोहराएं जब तक कि ई कोलाई को निलंबन से साफ नहीं कर दिया जाता। इसके बाद, कृमि गोली में 40% आइसोप्रोपेनॉल के 100 माइक्रोलीटर, या ओआरओ धुंधला के लिए 60% जोड़ें, और तीन मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूना को इनक्यूबेट करें।
- आइसोप्रोपैनॉल के अलावा धुंधला होने से पहले कीड़े के उचित पारमेबिलाइजेशन के लिए महत्वपूर्ण है।
- एक मिनट के लिए 560 बार गुरुत्वाकर्षण पर कीड़े को अपकेंद्रित्र करें और कीड़ा गोली को बाधित किए बिना सुपरनेट को हटा दें।
- अपकेंद्रित्र चरणों के दौरान प्रकाश जोखिम को कम करना महत्वपूर्ण है।
- अब, अंधेरे में रहते हुए, प्रत्येक नमूने में पहले से तैयार एनआर वर्किंग सॉल्यूशन के 600 माइक्रोलीटर जोड़ें। ट्यूबों को तीन बार उलटा करें और पूरी तरह से कीड़े और समाधान को मिलाएं। इसके बाद दो घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में नमूने को इनक्यूबेट करें।
इनक्यूबेशन के बाद कीड़े को सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट्ट को हटा दें। 30 मिनट तक अंधेरे में पीबीएसटी के 600 माइक्रोलीटर डालकर नमूनों को अंदर कर लें ताकि पहले की तरह फिर से नमूने घूमते रहें, लेकिन सुपरनैंट के लगभग 50 माइक्रोलीटर निकालें।
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