Analyse de paralysie induite par la natation (SWIP) : Une méthode pour quantifier la locomotion dopaminerique dans C. elegans

- Pour effectuer la paralysie nduced de natation-i, ou essai de SWIP, transférez L4 a mis en scène des larves de C. elegans à une plaque de tache en verre remplie de liquide. Identifiez des hermaphrodites L4 par la présence de la vulve en développement. Une tache en formede demi-lune au milieu du corps, et une queue fouet-comme.

Pour évaluer la natation à base de dopamine, enregistrez le mouvement du ver caractérisé par un comportement de flexion et de thrashing en forme de C. Habituellement, les neurones dopaminergiques libèrent la dopamine dans la fente synaptique, qui à son tour, lie les récepteurs de dopamine sur la cellule de réception.

Une fois le message transmis, la dopamine est libérée des récepteurs, et les neurotransmetteurs non liés peuvent être pris par le neurone dopaminergique par des protéines de transporteur spécialisées et réutilisés.

Chez les larves dont la signalisation dopaminergique est altérée, causée par l’activation de mutations dans le transporteur de dopamine ou les traitements médicamenteux qui augmentent la libération de dopamine, la dopamine s’accumule dans la fente synaptique. L’excès de dopamine stimule les récepteurs dopaminergiques qui interfèrent avec le programme moteur et laissent les larves paralysées. Les larves incapables de se déplacer descendront au fond de la plaque.

Dans le protocole d’exemple, nous verrons des démonstrations détaillées des analyses manuelles et automatisées de SWIP dans C. elegans traité avec l’amphétamine.

- Pour l’évaluation manuelle du SWIP, ajouter 40 microlitres de solution de contrôle avec ou sans amphétamine de 0,5 millimilliard dans une plaque de verre. Sous un stéréoscope, choisissez 8 à 10 vers de stade L4 tardifs avec un pic à cils, et submergez la pioche dans le puits contenant la solution jusqu’à ce que les vers se déplacent hors de la pioche et nagent dans la solution.

Démarrez la minuterie. Notez le nombre de vers relâchés dans le puits, et observez et enregistrez le nombre de vers présentant le SWIP à chaque marque de minute pendant un total de 10 minutes.

À la fin de la procédure, copiez les données brutes dans une feuille de calcul et calculez le pourcentage de vers paralysés en divisant le nombre de vers paralysés à chaque minute par le nombre total de vers testés tout au long de l’analyse et en multipliant par 100. Copiez les valeurs en pourcentage dans n’importe quel logiciel graphique et statistique et tracez les données avec des valeurs en pourcentage de SWIP sur l’axe Y et le temps sur l’axe x à l’aide du format graphique xy.

L’analyse statistique entre les groupes traités par le contrôle et les amphétamines et l’heure du traitement peuvent être effectuées. Par exemple, en utilisant une analyse anova et post-hoc dans les deux sens.

Pour une analyse automatisée de la paralysie induite par la natation, configurez la caméra, le logiciel de suivi des vers et le script pour exécuter l’analyse logicielle de suivi. Et utilisez un pic de cils pour placer un seul ver L4 à un stade avancé dans une plaque de tache de verre comme indiqué précédemment.

Ensuite, enregistrez des vidéos de natation d’un ver à la fois, et utilisez le logiciel de suivi des vers pour calculer la fréquence des courbures corporelles. Suite au script fourni avec le logiciel de suivi pour obtenir la fréquence de thrashing ver et de générer des cartes thermiques à partir des données de battement de ver.