Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- For å dissekere ringkjertelen trenger du et dissekerende mikroskop, to tang, en fin nål for å fungere som en dissekeringskniv og en bufret løsning. Finn ringkjertelen ved å identifisere larvens hode, som inneholder munnkrokene. Reis langs larvenes lengde for å finne hjernen, som ligger mellom thoraxen og bukseksjonene.
Larvalringkjertelen er en kompleks endokrine struktur som inneholder tre forskjellige endokrine organer. Corpus allatum sitter i midten av ringkjertelen og produserer juvenil hormon, som regulerer utvikling og aldring. Prothoracic kjertelen omgir corpus allatum og utgjør flertallet av strukturen. Ecdysone, et hormon involvert i insektmaling, er laget av denne kjertelen. Under prothoracic kjertelen er corpus cardiacum, som produserer adipokinetisk hormon, en næringsregulator.
I dette eksemplet vil vi dissekere larvalhjerner og ringkjertler for immunhiistokjemi.
- Etter å ha forberedt larvene, start kursspredningen i en tre centimeter tallerken fylt med PBS under et dissekerende mikroskop. Først griper du munnkroken med tang. Deretter, ved hjelp av mikrosaks, kutt kroppen på omtrent en tredjedel av lengden fra den fremre spissen. Deretter holder du den fremre lengden med ett par tang og bruker et annet par for å forsiktig skyve spissen av hodet inn i kroppen for å til slutt slå larvalkroppen ut.
Forbered opptil 20 larver på denne måten innen 10 minutter og overfør dem deretter til fikseringsløsning. Etter 30 minutter, vask preparatene og fortsett med immunostaining. Etter immunstaining larver, bruk en engangs pipette for å overføre prøvene til en tallerken fylt med 0,3% PBT.
Under et dissekerende mikroskop, ta tak i kutikylen eller munnkroken med ett par tang. Bruk deretter en 27-gauge nål festet til en en milliliter sprøyte som en kniv for å fjerne hjerneringkjertel-øyeskivekomplekset fra kroppskutteren ved å kutte bort den fremre spissen av spiserøret og øyeskivene.
Deretter bruker du tang, forsiktig skille spiserøret og tarmen fra hjerneringen kjertel-øye-øye-skive kompleks. Trekk tarmen ut til bakre side, siden spiserøret passerer gjennom hjernen over ventral nerveledning. Til slutt, for å isolere hjerneringkjertelkomplekset, kutt forsiktig forbindelsene mellom hjerneskiven, øyeskivene og benskivene med en nålkniv.
- Det er ganske viktig å bruke fine tang med skarpe kanter under disseksjonen. Jeg anbefaler også sterkt at du skjerper tang med en Arkansas slipestein for å bringe kantene sammen uten hull.
- For å overføre prøvene, bruk en mikropipette med en bred borespiss. Deponer prøvene på midten av glasssklie. Bruk deretter tang til å plassere prøvene på deres ventrale sider slik at ringkjertelen, som ligger på dorsalsiden av hjernen, kan avbildes. Deretter vipper du lysbildet og tørker av så mye av overflødig PBT som mulig. Deretter legger du en dråpe monteringsreagens nær prøvene og bruker tang for å sakte senke en dekslelip over reagenset, og deretter over prøvene.
