C. elegans Test de chimiotaxis: Une méthode pour tester la chimiosensation chez les vers

- Pour donner un sens aux conditions rencontrées et y répondre en conséquence, le ver C. elegans a, entre autres, un système chimiosensoriel très développé capable de détecter une grande variété de produits chimiques différents.

Les neurones sensoriels dans la tête, les neurones locaux amphid et intérieurs, ainsi que les neurones de la queue, les neurones phasmid, sont directement ou indirectement exposés par la cuticule aux conditions extérieures. Ces neurones chimiosensoriels codent les informations pertinentes utilisées par le ver pour produire une réponse comportementale appropriée : un comportement appelé chimiotaxis.

Pour tester la réponse chemotactique aux odorants volatils ou aux indices hydrosolubles gustatifs, isoler les vers du stade de développement désiré et les exposer au produit chimique d’essai sur une arène expérimentale précédemment préparée. Lorsqu’il est exposé à des produits chimiques favorables comme ceux produits par une source alimentaire bactérienne, C. elegans affiche des chimiotaxis positifs vers la source.

Inversement, lorsqu’il est exposé à des produits chimiques moins favorables ou toxiques comme les métaux lourds, le ver présente des chimiotaxis négatifs, évitant le produit chimique. Par conséquent, les mutants olfactifs ou gustatifs ne parviennent pas à éviter les produits chimiques aversifs et restent dans des conditions défavorables contrairement aux animaux de type sauvage qui évitent l’état aversif.

Dans le protocole de l’exemple, nous verrons une démonstration d’un test de chimiotaxis, testant l’aversion du ver pour le cuivre.

- Après l’incubation pendant la nuit, retirer les plaques de l’incubateur et en utilisant le dessous marqué de la plaque comme un guide, pipette 100 microlitres de cuivre nouvellement préparé 0,5 molar deux solution de sulfate sur le bord de l’agar pour créer une barrière extérieure de cuivre. Pipette 25 microlitres de la solution de cuivre deux sulfate pour créer une barrière médiane.

Assurez-vous que la solution de deux sulfate de cuivre n’entre pas en contact avec la tache bactérienne et laissez la solution de cuivre sécher sur la plaque. Vérifiez la sécheresse toutes les cinq minutes après le transfert avec un tissu de laboratoire en tamponnant légèrement la solution près du bord de la plaque pour discerner.

Immédiatement avant l’essai, transférez les organismes expérimentaux dans une plaque d’agar exempte de bactéries et laissez les nématodes se déplacer librement pendant une minute pour éliminer l’excès de bactéries.

Ensuite, pipette 1 millilitre de M9 sur la plaque avec de jeunes adultes qui ont été transférés 24 heures auparavant afin de laver les vers dans un tube de microcentrifugeuse. Centrifugeuse les nématodes à 3000 fois g pendant une minute.

Les vers doivent former une pastille au fond du tube. Aspirer la solution M9 sans perturber la pastille de ver. Ajouter 1 millilitre de solution M9 à la pastille de ver. Tube inversé pour mélanger les vers avec la solution.

Si l’excès de bactéries a d’abord été transféré avec les vers, répétez pour un total de cinq fois. Après le lavage final, aspirez le supernatant jusqu’à ce que 100 microlitres de solution M9 et la pastille de ver reste. Transférez immédiatement les vers de la solution une fois les étapes de lavage terminées.

Pipette 20 microlitres de la pastille de ver du fond du tube sur la moitié sans bactéries de la plaque d’essai. Assurez-vous que 10 vers sont transférés dans la plaque d’analyse et qu’aucun aliment contaminant n’est présent. Aucune bactérie ne doit être transférée dans les plaques de course des aliments en cuivre.

Retirer l’excès de solution M9 des nématodes avec un tissu de laboratoire dans un délai d’une minute. Assurez-vous que la solution M9 n’entre pas en contact avec la solution de deux sulfate de cuivre et que les vers et la surface de l’agar demeurent intacts. Jetez les vers qui ont été accidentellement enlevés avec le tissu de laboratoire.

Une fois que la solution M9 a été enlevée et que tous les vers ont commencé les modèles locomoteurs non liquides, c’est-à-dire lorsqu’ils ont cessé de battre, démarrez le chronomètre d’essai. Si des vers supplémentaires ont été accidentellement inclus, retirez-les en les cueillant avec de l’huile d’halocarbone pour s’assurer qu’aucune bactérie n’est ajoutée à la plaque.

Vérifiez les plaques d’analyse toutes les 30 minutes. Pour les plaques d’analyse avec des taches bactériennes, marquer positivement les organismes s’ils ont atteint le patch alimentaire sur une période de quatre heures. Pour les plaques de contrôle négatives, marquer positivement les organismes s’ils ont franchi la barrière.