C. elegans Chemotaxis Assay: Eine Methode, um Chemosensation in Worms zu testen

- Um die angetroffenen Bedingungen zu verstehen und entsprechend darauf zu reagieren, verfügt der Wurm C. elegans unter anderem über ein hochentwickeltes chemosensorisches System, das in der Lage ist, eine Vielzahl verschiedener Chemikalien zu erkennen.

Sensorische Neuronen im Kopf, die amphiden und inneren Labialneuronen, sowie Neuronen im Schwanz, die Phasmidneuronen, werden entweder direkt oder indirekt durch die Nagelhaut den äußeren Bedingungen ausgesetzt. Diese chemosensorischen Neuronen kodieren relevante Informationen, die vom Wurm verwendet werden, um eine angemessene Verhaltensreaktion zu erzeugen: ein Verhalten, das als Chemotaxis bezeichnet wird.

Um die chemotaktische Reaktion auf flüchtige Geruchsstoffe oder böige wasserlösliche Cues zu testen, isolieren Sie Würmer des gewünschten Entwicklungsstadiums und setzen Sie sie der Prüfchemikalie auf einer zuvor vorbereiteten Versuchsarena aus. Wenn sie günstigen Chemikalien ausgesetzt sind, wie sie von einer bakteriellen Nahrungsquelle produziert werden, zeigt C. elegans positive Chemotaxis zur Quelle hin.

Umgekehrt zeigt der Wurm, wenn er weniger günstigen oder toxischen Chemikalien wie Schwermetallen ausgesetzt ist, negative Chemotaxis und vermeidet die Chemikalie. Daher vermeiden olfaktorische oder gustatorische Mutanten aversive Chemikalien nicht und bleiben in ungünstigen Bedingungen im Gegensatz zu Wildtieren, die den aversiven Zustand vermeiden.

Im Beispielprotokoll wird eine Demonstration eines Chemotaxis-Assays zu sehen sein, der die Abneigung des Wurms gegen Kupfer testet.

- Nach der nächtlichen Inkubation, entfernen Sie Platten aus dem Inkubator und verwenden Sie die markierte Unterseite der Platte als Führung, Pipette 100 Mikroliter frisch zubereitet eisern 0,5 Molar Kupfer zwei Sulfatlösung am Rand des Agars, um eine äußere Kupferbarriere zu schaffen. Pipette 25 Mikroliter der Kupfer-Zwei-Sulfat-Lösung, um eine Mittellinie Barriere zu schaffen.

Stellen Sie sicher, dass die Kupfer-Zwei-Sulfat-Lösung nicht mit dem bakteriellen Pflaster in Berührung kommt, und lassen Sie die Kupferlösung auf die Platte trocknen. Prüfen Sie alle fünf Minuten nach der Übertragung mit einem Laborgewebe auf Trockenheit, indem Sie die Lösung in der Nähe des Plattenrands leicht zu erkennen.

Unmittelbar vor dem Test die Versuchsorganismen auf eine bakterienfreie Agarplatte übertragen und die Nematoden für eine Minute frei bewegen lassen, um überschüssige Bakterien zu entfernen.

Als nächstes Pipette 1 Milliliter M9 auf die Platte mit jungen Erwachsenen, die 24 Stunden zuvor übertragen wurden, um Würmer in ein Mikrozentrifugenrohr zu waschen. Zentrifugieren Sie die Nematoden bei 3.000 mal g für eine Minute.

Würmer sollten ein Pellet an der Unterseite des Rohres bilden. Aspirieren M9 Lösung ohne Störung des Wurmpellets. Fügen Sie 1 Milliliter M9-Lösung zum Wurmpellet. Invertieren Rohr, um Würmer mit der Lösung zu mischen.

Wenn überschüssige Bakterien zunächst mit den Würmern übertragen wurden, insgesamt fünfmal wiederholen. Nach der letzten Wäsche den Überstand bis 100 Mikroliter M9-Lösung ansaugen und das Wurmpellet übrig bleibt. Würmer sofort von der Lösung übertragen, sobald die Waschschritte abgeschlossen sind.

Pipette 20 Mikroliter des Wurmpellets vom Boden des Rohres auf die bakterienfreie Hälfte der Assayplatte. Achten Sie darauf, dass 10 Würmer auf die Assayplatte übertragen werden und keine kontaminierende Nahrung vorhanden ist. Es sollten keine Bakterien auf die Kupferfutter-Rennplatten übertragen werden.

Entfernen Sie überschüssige M9-Lösung aus den Nematoden mit einem Laborgewebe innerhalb einer Minute. Stellen Sie sicher, dass die M9-Lösung nicht mit der Kupfer-Zwei-Sulfat-Lösung in Berührung kommt und dass die Würmer und die Agaroberfläche intakt bleiben. Entsorgen Sie Würmer, die versehentlich mit dem Laborgewebe entfernt wurden.

Sobald die M9-Lösung entfernt wurde und alle Würmer nicht-flüssige Bewegungsmuster begonnen haben, d.h. wenn sie aufgehört haben zu dreschen, starten Sie die Teststoppuhr. Wenn zusätzliche Würmer versehentlich enthalten waren, entfernen Sie sie, indem Sie mit Halocarbonöl pflücken, um sicherzustellen, dass der Platte keine Bakterien zugesetzt werden.

Überprüfen Sie die Testplatten alle 30 Minuten. Für die Assayplatten mit bakteriellen Flecken, bewerten Sie Organismen positiv, wenn sie das Nahrungspflaster über einen Zeitraum von vier Stunden erreicht haben. Für die negativen Kontrollplatten bewerten Sie Organismen positiv, wenn sie die Barriere überschritten haben.