К. Элеганс Chemotaxis Assay: Метод проверки химиосенсации у червей

- Чтобы разобраться в встречах и реагировать на них соответствующим образом, червь C. elegans имеет, среди прочего, высокоразвитую химиосенсорную систему, способную обнаруживать широкий спектр различных химических веществ.

Сенсорные нейроны в голове, амфидные и внутренние половые нейроны, а также нейроны в хвосте, фазмидные нейроны, прямо или косвенно подвергаются через кутикулу внешним условиям. Эти хемосенсорные нейроны код соответствующей информации, используемой червя для получения соответствующей поведенческой реакции: поведение называют хемотаксис.

Чтобы проверить химиотаксическую реакцию на летучие запахи или вкусовые водорастворимые сигналы, изолировать червей желаемой стадии развития и подвергать их испытанию химических веществ на ранее подготовленной экспериментальной арене. При воздействии благоприятных химических веществ, как те, которые производятся бактериального источника пищи, C. elegans отображает положительные хемотаксис к источнику.

Обратно, при воздействии менее благоприятных или токсичных химических веществ, таких как тяжелые металлы, червь отображает отрицательный хемотаксис, избегая химического вещества.

В примере протокола мы увидим демонстрацию анализа хемотаксиса, проверяя отвращение червя к меди.

- После ночной инкубации, удалить пластины из инкубатора и с помощью отмеченной нижней части пластины в качестве руководства, пипетка 100 микролитров свежеприготовленных 0,5 молир меди два сульфата раствор на краю агара для создания внешнего медного барьера. Pipette 25 микролитров меди два сульфатного раствора для создания барьера средней линии.

Убедитесь, что медь два сульфата раствор не контакт бактериальный патч, и позволяют медного раствора высохнуть на пластине. Проверка на сухость каждые пять минут после передачи с лабораторной ткани слегка dabbing раствор вблизи края пластины, чтобы различить.

Непосредственно перед анализом перенесите экспериментальные организмы на агарную пластину без бактерий и позвольте нематодам свободно перемещаться в течение одной минуты для удаления избыточных бактерий.

Далее, пипетка 1 миллилитр M9 на тарелку с молодыми взрослыми, которые были переданы 24 часа назад для того, чтобы мыть червей в трубку микроцентрифуг. Центрифуга нематод в 3000 раз г в течение одной минуты.

Черви должны образовывать гранулы в нижней части трубки. Аспират M9 решение, не нарушая червя гранулы. Добавить 1 миллилитр M9 раствор червя гранулы. Инверт трубки смешать червей с раствором.

Если избыток бактерий изначально передавались с червями, повторите в общей сложности пять раз. После окончательной стирки, аспирировать супернатант до 100 микролитров раствора M9 и червя гранулы остается.

Pipette 20 микролитров червя гранулы из нижней части трубки на бактерии свободной половине анализной пластины. Убедитесь, что 10 червей передаются на анализ пластины и что нет загрязняющих пищевых продуктов присутствует.

Удалите избыток раствора M9 из нематод с лабораторной тканью в течение одной минуты. Убедитесь, что раствор M9 не контактируют с медным двух сульфатным раствором, и что черви и поверхность агара остаются нетронутыми.

После того, как раствор M9 был удален и все черви начали неликвидных локомотивных моделей, т.е. когда они перестали обмолота, начать анализ секундомер.Если дополнительные черви были случайно включены, удалить их, выбирая с галоуглеродного масла для обеспечения того, чтобы бактерии не добавляются в пластину.

Проверьте анализ пластин каждые 30 минут. Для анализа пластин с бактериальными пятнами, положительно оценка организмов, если они достигли пищевой патч в течение четырех часов. Для отрицательного контроля пластин, положительно оценка организмов, если они пересекли барьер.