C. elegans Kemotaxisanalys: En metod för att testa chemosensation i maskar

- För att förstå påträffade förhållanden och reagera på dem därefter har masken C. elegans bland annat ett välutvecklat kemosensoriskt system som kan upptäcka en mängd olika kemikalier.

Sensoriska nervceller i huvudet, amphid och inre labial nervceller, liksom nervceller i svansen, phasmid nervceller, utsätts antingen direkt eller indirekt genom nagelband till yttre villkor. Dessa kemosensoriska nervceller kod relevant information som används av masken för att producera ett lämpligt beteendemässiga svar: ett beteende som kallas chemotaxis.

För att testa det kemotaktiska svaret på antingen flyktiga luktämnen eller gustatory vattenlösliga signaler, isolera maskar i önskat utvecklingsstadium och exponera dem för testkemikalien på en tidigare förberedd experimentell arena.

Omvänt, när den utsätts för mindre gynnsamma eller giftiga kemikalier som tungmetaller, visar masken negativ chemotaxis, undviker kemikalien.

I exempelprotokollet kommer vi att se en demonstration av en kemotaxisanalys, som testar maskens motvilja mot koppar.

- Efter inkubation över natten, ta bort plattor från inkubatorn och använd den markerade undersidan av plattan som guide, pipett 100 mikroliter nyberedd 0,5 molar koppar två sulfatlösning på kanten av agaren för att skapa en yttre kopparbarriär. Pipett 25 mikroliter av koppar två sulfatlösning för att skapa en mittlinjebarriär.

Se till att kopparns två sulfatlösning inte kommer i kontakt med bakterieplåstret och låt kopparlösningen torka på plattan.

Omedelbart före analysen överför du de experimentella organismerna till en bakteriefri agarplatta och låter nematoderna röra sig fritt i en minut för att avlägsna överflödiga bakterier.

Därefter pipett 1 milliliter M9 på plattan med unga vuxna som överfördes 24 timmar tidigare för att tvätta maskar i ett mikrocentrifugrör.

Maskar ska bilda en pellets i botten av röret. Aspirate M9-lösning utan att störa maskpelleten. Tillsätt 1 milliliter M9-lösning till maskpelleten. Invertera röret för att blanda maskar med lösningen.

Om överskott av bakterier ursprungligen överfördes med maskarna, upprepa för totalt fem gånger. Efter den slutliga tvätten, aspirera supernaten tills 100 mikroliter M9-lösning och maskpelleten kvarstår. Överför omedelbart maskar från lösningen när tvättstegen har slutförts.

Pipett 20 mikroliter av maskpelleten från botten av röret till den bakteriefria halvan av analysplattan.

Ta bort överflödig M9-lösning från nematoderna med laboratorievävnad inom en minut. Se till att M9-lösningen inte kommer i kontakt med kopparns två sulfatlösning och att maskarna och agarytan förblir intakta. Kassera maskar som oavsiktligt har avlägsnats med laboratorievävnaden.

När M9-lösningen har tagits bort och alla maskar har börjat icke-flytande lokomotoriska mönster, dvs. när de har slutat slå, starta analysstoppuret. Om extra maskar oavsiktligt ingick, ta bort dem genom att plocka med halokarbonolja för att säkerställa att inga bakterier tillsätts på plattan.

Kontrollera analysplattor var 30: e minut. För analysplattorna med bakteriella fläckar, poängorganismer positivt om de nådde matplåstret under en fyratimmarsperiod.