C. elegans Bevegelsessporing: En metode for å vurdere bevegelse i ormer

- For å vurdere bevegelse i C. elegans, bruk et kamera for å registrere ormenes bevegelse på en agarplate, og sørg for jevn belysning av platen under opptaket. For å begrense ormenes bevegelse rundt platen, bruk kobberringer. Kobber er aversive til C. elegans, så ormer er corralled innenfor ringene.

Plasser flere kobberringer på en plate for samtidig å spore ormer i hver ring. Dette gjør det mulig å vurdere kontroll og eksperimentelle dyr som skal utføres under identiske forhold, redusere daglig variasjon og tillate side om side sammenligninger. Registrer ormenes bevegelse over angitte tidsintervaller, og bruk dataprogramvare til å analysere egenskapene til lokomotivets oppførsel, for eksempel bevegelseshastigheten og tilbakelagt avstand.

I eksempelprotokollen vil vi se en demonstrasjon av en bevegelsessporingsanalyse som tester effekten av alkohol på ormens bevegelseshastighet.

- Til å begynne med, ta to minutter eller mindre å overføre 10 ormer fra hver eksperimentell gruppe til midten av en kobberring på en akklimatiseringsplate. Dette er en tallerken uten etanol. Unngå å overføre mat med ormene, da det vil redusere bevegelsen. Unngå også å skade agaroverflaten fordi ormene vil grave. Registrer lastetiden på platen, og sørg for å forskyve overføringen av ormer til hver plate med over to minutter, slik at hver tallerken kan filmes individuelt med riktig tidsintervall.

La hver akklimatiseringsplate inkubere ved romtemperatur i 30 minutter. Overfør deretter ormene til analyseplaten, etter rekkefølgen som brukes til å plassere ormene på akklimatiseringsplaten. Bruk deretter en tynnkantet flatt ormplukk uten bakterier, samle ormene på toppen av det flate plukket ved hjelp av en scooping bevegelse. Deretter forsegler du platen med laboratoriefilm for å minimere tap av etanol til fordampning.

- Hastigheten dyrene overføres med på dette trinnet er svært viktig, fordi de overførte dyrene vil bli utsatt for etanol lenger. Så det er en god ide å rotere hvilke stammer som plasseres på platen først over eksperimentelle replikeringer.

- Et mikroskop med høyoppløselig videokamera er nødvendig for å filme ormene nå. Selv belysning, for eksempel fra en tretommers firkantet bakgrunnsbelysning, er avgjørende for analysen.

Klargjør bildeanalyseprogramvaren for å ta opp 120-bilder, 12-biters, gråtone- og tidsforløpfilmer i ett delbilde per sekund. For å redusere størrelsen på utdatafilen, samtidig som du beholder tilstrekkelig bildeoppløsning, bruker du en to-ganger-to-skuffningsmodus.

Ta nå opp to-minutters filmer fra hver plate, 10 minutter etter at de siste ormene ble plassert på den platen. Gjør deretter et nytt to-minutters opptak, 30 minutter etter at ormer ble plassert på platen. For denne demonstrasjonen brukes Image-Pro Plus-programvaren, da et bredt utvalg av annen programvare kan tilpasses teknikken.

Bruk først et filter på bildene som slår sammen bakgrunnen og forbedrer kontrasten til ormeobjektene.

Nå analyserer du dyrenes bevegelse i hver ring separat med et sirkulært område av interesse som overlapper kobberringen. Identifiser og spor ormene med kommandoen Spor objekter under Mål-undermenyen.

I vinduet Sporingsdatatabell bruker du Knappen Sporingsalternativer til å tillate at bestemte spor utelates og begrense eventuelle eksperimentelle artefakter. Under kategorien Automatisk sporing setter du sporparameterne til en hastighetsgrense på 400 mikron per ramme.

Sett minimum total sporlengde til 400 mikron, og sett den dominerende bevegelsestypen til Kaotisk. Angi deretter objektene under Sporparameter for å tillate delvise spor å ha en minimumslengde på 21 bilder og ha en sporingsprojeksjonsdybde på ett bilde.

Nå, for å starte sporingsprosessen, klikker du først på Knappen Søk etter alle spor automatisk. Dette viser dialogboksen Alternativer for antall/størrelse og dialogboksen Sporingsdialogboks. Velg det manuelle alternativet for valg av intensitetsområde i dialogboksen Antall/størrelse. Dette gir et viktig terskeltrinn. Deretter justeres glidebryterne for intensitetsterskel for å opprette et inkluderende område som uthever mørke objekter. Et godt utgangspunkt på skalaen er mellom 0 og 1500.

Bruk nå et størrelsesfilter for å utelate objekter som er større eller mindre enn en enkelt orm. Gå til Mål-menyen, og velg deretter Målundermeny. Dette åpner dialogboksen Alternativer for antall/størrelse. Der setter du områdeområdet til 28 000 til 120 000 kvadratmikroner.

Nå fullfører du sporingsprosessen ved å klikke Fortsett i sporingsdialogboksen. Dobbeltsjekk at utdataene sporer med filmopptakene. Kontroller at hver orm er representert med mindre det er en klar grunn til å filtrere den. Deretter sletter du spor som produseres av ikke-ormeobjekter, manuelt.

Deretter beregner du hastigheten for hver orm ved å beregne gjennomsnittet av tilbakelagt avstand mellom hvert delbilde eller hvert sekund, og opprette en gjennomsnittlig hastighet for sporene i hver populasjon.