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Encyclopedia of Experiments: Biology

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C. elegans Seguimiento del movimiento

 
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C. elegans Seguimiento del movimiento: un método para evaluar la locomoción en gusanos

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- Para evaluar la locomoción en C. elegans, utilice una cámara para grabar el movimiento de los gusanos en una placa de agar, asegurando incluso la iluminación de la placa durante la grabación.

Coloque varios anillos de cobre en una placa para rastrear simultáneamente gusanos en cada anillo. Esto permite que la evaluación del control y los animales experimentales se realicen en condiciones idénticas, reduciendo la variabilidad del día a día y permitiendo comparaciones lado a lado. Registre el movimiento de los gusanos a través de intervalos de tiempo establecidos, y utilice software informático para analizar las características del comportamiento de la locomotora, como la velocidad de movimiento y la distancia recorrida.

En el protocolo de ejemplo, veremos una demostración de un ensayo de seguimiento de movimiento que prueba los efectos del alcohol en la velocidad de locomoción del gusano.

- Para empezar, tómese dos minutos o menos para transferir 10 gusanos de cada grupo experimental al centro de un anillo de cobre en una placa de aclimatación. Este es un plato sin etanol. Evite transferir alimentos con los gusanos ya que reducirá su movimiento. También evite dañar la superficie del agar porque los gusanos se enterrarán.

Deje que cada placa de aclimatación se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, transfiera los gusanos a la placa de ensayo, siguiendo el orden utilizado para colocar los gusanos en la placa de aclimatación. Usando una selección de gusano aplanado de borde fino sin bacterias, recoger los gusanos en la parte superior de la selección aplanada usando un movimiento de recolección.

- La velocidad a la que se transfieren los animales a este paso es muy importante, ya que los animales transferidos estarán expuestos al etanol por más tiempo.

- Se requiere un microscopio con cámara de vídeo de alta resolución para filmar los gusanos ahora. Incluso la iluminación, como desde una retroiluminación cuadrada de tres pulgadas, es vital para el análisis.

Prepare el software de análisis de imágenes para capturar películas de 120 fotogramas, 12 bits, escala de grises y lapso de tiempo en un fotograma por segundo.

Ahora graba películas de dos minutos de cada plato, 10 minutos después de que los últimos gusanos fueron colocados en esa placa. Luego haz una segunda grabación de dos minutos, 30 minutos después de que los gusanos fueron colocados en la placa. Para esta demostración se utiliza el software Image-Pro Plus, ya que una amplia variedad de otros programas se pueden adaptar a la técnica.

Primero aplique un filtro a las imágenes que aplanan el fondo y mejore el contraste de los objetos de gusano.

Ahora, analice la locomoción de los animales en cada anillo por separado con una región circular de interés que superponga el anillo de cobre.

En la ventana Tabla de datos de seguimiento, utilice el botón Opciones de seguimiento para permitir excluir pistas específicas y limitar cualquier artefacto experimental.

Establezca la longitud mínima total de la pista en 400 micras y establezca el tipo de movimiento predominante en Caótico.

Ahora, para iniciar el proceso de seguimiento, primero haga clic en el buscar todas las pistas Automáticamente botón de función. Esto abre el cuadro de diálogo Opciones de recuento/tamaño y el cuadro de diálogo Seguimiento. Seleccione la opción Manual para la Selección de rango de intensidad en el cuadro de diálogo Recuento/Tamaño.

Ahora aplique un filtro de tamaño para excluir objetos que sean mayores o menores que un solo gusano. Vaya al menú Medir y, a continuación, seleccione Submenú De medición. Esto abre el cuadro de diálogo Opciones de recuento/tamaño.

Ahora, complete el proceso de seguimiento haciendo clic en Continuar en el cuadro de diálogo de seguimiento. Compruebe dos veces que las pistas de salida con el material de archivo de la película.

A continuación, calcule la velocidad de cada gusano promediando la distancia recorrida entre cada fotograma o cada segundo, y cree una velocidad media para las pistas de cada población.

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