Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Criar matrizes de DNA extracromosômicos por microinjeção - o método mais simples para gerar cepas de vermes transgênicos - resulta em elementos genéticos que não são transmitidos de forma estável durante a divisão celular e, portanto, apresentam taxas de herança variável e níveis de expressão.
Para isso, comece com uma população sincronizada por idade de vermes transgênicos L4, que carregam uma matriz extracromosomal introduzida anteriormente pela microinjeção e permitem que eles cresçam em adultos gravid. Transfira esses adultos para novas placas e permita que eles coloquem ovos até que haja pelo menos 30 ovos em cada prato. Remova os adultos e permita que os ovos cresçam até chegarem ao estágio L4. Em seguida, irradie os vermes com luz UV. Isso causa quebras aleatórias de dois fios no DNA genômico onde o maquinário de reparação de DNA dos vermes pode incorporar arbitrariamente a matriz.
Após um período de recuperação durante a noite, conte o número de vermes sobreviventes. Uma pequena porcentagem de vermes mortos indica uma irradiação eficiente. Observe as gerações subsequentes para isolar linhas transgênicas homozigosas integradas. No protocolo de exemplo, integraremos uma alta taxa de transmissão extracromosomal matriz carregando um marcador de co-injeção fluorescente expresso na farxe.
- Avaliar a taxa de transmissão da linha transgênica a ser integrada. Para cada linha transgênica, escolha 10 adultos gravid fluorescentes em 10 placas de cultura separadas sob um estereoscópio fluorescente. Cultura os animais em uma incubadora de vermes fixada a uma temperatura permissiva à reprodução do fundo genético.
Monitore a prole todos os dias para avaliar qual estágio de desenvolvimento o marcador de co-injeção é expresso e pode ser melhor observado. Utilizando estereoscopia fluorescente, avalie a taxa de transmissão da prole determinando o percentual de progêneria fluorescente. Para a integração transgênica, selecione a linha transgênica com a maior taxa de transmissão.
Obtenha uma população de animais transgênicos sincronizados no estágio larval L4 para integração. Escolha 30 adultos gravid fluorescentes em cinco placas de cultura. Depois que os vermes colocarem ovos por três a quatro horas a 15 graus Celsius, verifique a presença de pelo menos 30 ovos por placa e, em seguida, elimine os adultos das placas.
Cultue os animais em uma incubadora de vermes até que a prole atinja o estágio larval L4. Coloque cada placa contendo 15 a 20 animais transgênicos fluorescentes L4 em um crosslinker UV com as tampas removidas.
Para recuperação, incubar os vermes irradiados durante a noite a 15 graus Celsius. Verifique o número de animais vivos. Em nossas mãos, uma taxa de sobrevivência de cerca de 80% a 90% é adaptativa para uma irradiação eficiente.
