Encyclopedia of Experiments: Biology
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- La création de tableaux d’ADN extrachromosomiques par microinjection - la méthode la plus simple pour générer des souches de vers transgéniques - entraîne des éléments génétiques qui ne sont pas transmis de façon durable pendant la division cellulaire et, par conséquent, présentent des taux d’héritage et des niveaux d’expression variables. L’objectif de l’intégration du tableau dans un chromosome est de réduire cette instabilité et cette variabilité génétiques.
Pour ce faire, commencez par une population synchronisée d’âge de vers transgéniques L4, qui portent un tableau extrachromosomique précédemment introduit par microinjection et leur permettent de se développer en adultes gravid. Transférez ces adultes dans de nouvelles assiettes et laissez-leur pondre jusqu’à ce qu’il y ait au moins 30 œufs dans chaque assiette. Retirez les adultes et laissez les œufs grandir jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade L4. Ensuite, irradier les vers avec de la lumière UV. Cela provoque des ruptures aléatoires à double brin dans l’ADN génomique où les machines de réparation de l’ADN des vers peuvent arbitrairement incorporer le tableau.
Après une période de rétablissement d’une nuit, comptez le nombre de vers survivants. Un faible pourcentage de vers morts indique une irradiation efficace. Observez les générations suivantes pour isoler les lignées transgéniques intégrées homozygotes. Dans le protocole d’exemple, nous intégrerons un tableau extrachromosomique à taux de transmission élevé portant un marqueur fluorescent de co-injection exprimé dans le pharynx.
- Évaluer le taux de transmission de la lignée transgénique à intégrer. Pour chaque lignée transgénique, choisissez 10 adultes gravid fluorescents sur 10 plaques de culture distinctes sous un stéréoscope fluorescent. Culture des animaux dans un incubateur de vers réglé à une température permissive à la reproduction du fond génétique.
Surveiller la descendance chaque jour pour évaluer le stade de développement auquel le marqueur de co-injection est exprimé et peut être observé le mieux. À l’aide de la stéréoscopie fluorescente, évaluer le taux de transmission de la descendance en déterminant le pourcentage de descendance fluorescente. Pour l’intégration transgénique, sélectionnez la ligne transgénique avec le taux de transmission le plus élevé.
Obtenir une population d’animaux transgéniques synchronisés au stade larvaire L4 pour l’intégration. Choisissez 30 adultes gravid fluorescents sur cinq plaques de culture. Après que les vers ont pondu des œufs pendant trois à quatre heures à 15 degrés Celsius, vérifiez la présence d’au moins 30 œufs par plaque, puis éliminez les adultes des assiettes.
Culture des animaux dans un incubateur de vers jusqu’à ce que la progéniture atteigne le stade larvaire L4. Placez chaque plaque contenant de 15 à 20 animaux transgéniques fluorescents L4 dans un lien croisé UV avec les couvercles enlevés. Irradier les vers.
Pour la récupération, incuber les vers irradiés pendant la nuit à 15 degrés Celsius. Vérifiez le nombre d’animaux vivants. Entre nos mains, un taux de survie d’environ 80 % à 90 % est adaptatif pour une irradiation efficace. Cultivez les animaux irradiés à 15 à 25 degrés Celsius jusqu’à ce que la progéniture ait atteint le stade de développement permettant l’observation de l’expression du marqueur de co-injection.
