La transfection d'anticorps dans les neurones comme outil pour étudier la pathogenèse des maladies

L’objectif de cette procédure est de fournir une approche rapide et reproductible pour étudier comment les anticorps, les mécanismes automoléculaires liés à la fonction neuronale et la pathogenèse des maladies neurologiques. Tout d’abord, les anticorps sont marqués à l’aide d’un marqueur fluorescent ATO 50 NHS. Ensuite, les anticorps sont mélangés au réactif de transfection, puis transfectés dans des cellules neuronales.

En culture, 48 heures après la transfection, les neurones sont fixés montés avec un milieu DPI et visualisés par microscopie d’immunofluorescence. L’efficacité de transfection peut être calculée à l’aide d’un logiciel d’imagerie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en neurosciences et en neuroimmunologie, telles que la façon dont les auto-anticorps modifient les mécanismes moléculaires liés à la fonction neuronale et à la pathogenèse des maladies neurologiques à médiation immunitaire.

Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons voulu tester l’hypothèse selon laquelle les anticorps à h et RPA one et à la protéine de liaison à l’ARN surexprimée dans les neurones contribuaient au mécanisme de neurodégénérescence démontrant la procédure sera Josh Douglas, un étudiant diplômé Avant de commencer la procédure. S’assurer que des cellules neuronales intactes de haute qualité, plaquées à 100 000 cellules par puits et d’au moins 80 % de cofluent, sont disponibles la veille des expériences. Le jour du test, observez les cellules pour vous assurer qu’elles sont en bonne santé.

Commencez par préparer un tampon de bicarbonate de sodium de 0,1 mil en mélangeant 8,4 grammes de bicarbonate de sodium et 29,2 grammes de chlorure de sodium dans un litre d’eau. Ajustez ensuite le pH du tampon à 8,4 à 500 microlitres de tampon. Ajoutez 70 microlitres de l’anticorps à transfecter dans ce cas, un anti H-N-R-N-P-A et 35 microlitres du réactif de marquage ici à oh cinq 50 NHS.

Faites tourner la solution à température ambiante pendant une heure, puis injectez-la dans un dialyseur et dialysez-la dans deux litres de PBS à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, utilisez une colonne de spin pour concentrer l’anticorps marqué au dialyse. Enfin, déterminez la concentration d’anticorps à l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop.

Dans une lame de huit puits, voir 10 000 cellules par puits dans un volume de 500 microlitres de DMEM complet. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit ou jusqu’à ce que la cofluence cellulaire atteigne au moins 70 % une fois que les cellules sont à 70 % de cofluent. Commencez la procédure en mélangeant deux microlitres d’anticorps, en délivrant les réactifs de transfection et deux microgrammes d’anticorps marqués à 0,5 microgramme par microlitre dans un einor et incubez la solution pendant 10 à 15 minutes à température ambiante.

Entre-temps, retirez le SUP natum des puits de culture cellulaire et remplacez-le par exactement 394 microlitres par puits, un milieu frais. Une fois que la solution de transfection est prête, ajoutez 100 microlitres de DMEM et mélangez en pipetant de haut en bas. Ajoutez ensuite exactement 106 microlitres de mélange de transfection dans chaque puits contenant des cellules pour obtenir un volume final de 500 microlitres par puits.

Assurez-vous d’inclure un puits de contrôle négatif UNT TRANSFECTED dans lequel du DMEM plutôt qu’un anticorps est ajouté. Incuber les cellules pendant 48 heures à 37 degrés Celsius. Suite à cette incubation, remplacer le milieu par du DMEM frais, effectuer l’imagerie en direct à l’aide d’un microscope fluorescent 48 heures après l’étiquetage.

Pour visualiser les anticorps marqués ATO 50 NHS, utilisez le filtre SI trois après l’aspiration de l’imagerie en direct du milieu et fixez les cellules en ajoutant 4 % de paraldéhyde et en incubant la lame pendant 15 minutes à température ambiante. Une fois les cellules fixées, lavez-les quatre fois dans du PBS en laissant une période d’incubation de cinq minutes dans le PBS pour chaque lavage. Retirez ensuite le PBS et ajoutez une goutte de support de montage contenant DPI.

Pour chacun, placez doucement une lamelle sur le dessus des cellules à l’aide d’un microscope fluorescent. Commencez à imager les cellules. Dans cette expérience, nous avons réalisé une imagerie cellulaire fluorescente en direct de neurones transfectés avec succès avec cinq anticorps anti H-N-R-N-P-A marqués par l’ATO 50 NHS.

Cette image montre les anticorps à l’intérieur des cellules neuronales, y compris les processus neuronaux du cytoplasme, ainsi que la fixation et la coloration du noyau. L’utilisation du DPI indiqué ici en bleu permet de déterminer l’efficacité de transfection en divisant le nombre de cellules transfectées par le nombre total de cellules. Dans ce cas, l’efficacité est de 50 %Suite à cette procédure.

D’autres méthodes telles que l’immuno-chimie, l’ARN, l’extraction, l’analyse micrologique et les transferts Western peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la colocalisation des anticorps dans les organites cellulaires, ainsi que les modifications de la fonction et de l’intégrité neuronales liées à la spécificité de l’anticorps pour l’antigène cible. Dans cette vidéo, nous avons montré comment marquer des anticorps avec un marqueur fluorescent, préparer un complexe de réactifs de transfection avec des anticorps marqués par fluorescence, transfecter des neurones et calculer l’efficacité de la transfection. Cette méthode est utile dans l’évaluation de la façon dont les auto-anticorps affectent les fonctions cellulaires telles que la viabilité, l’apoptose, le transport neuronal, ainsi que les mécanismes moléculaires liés à la fonction neuronale et à la pathogenèse des maladies neurologiques.