Imaging Glioma Iniziazione In Vivo Attraverso un lucido e sottile rinforzato cranio finestra craniale

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare le fasi iniziali dell'inizio del glioma da singole cellule di glioblastoma iniettate in vivo. Ciò si ottiene con il primo assottigliamento, un'area del cranio di topo fino a uno spessore adatto per l'imaging in vivo. Successivamente, l'area sottile del cranio viene lucidata.

Quindi le cellule di glioblastoma marcate con GFP vengono iniettate nel cervello del topo e la finestra cranica viene sigillata per l'imaging in vivo. Infine, le cellule di glioblastoma iniettate vengono visualizzate quotidianamente per visualizzare l'inizio del glioma dalle cellule di glioblastoma iniettate in vivo. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano l'inizio del glioma in vivo da una singola iniezione di cellule di glioblastoma e la sua relazione con le cellule endoteliali vascolari attraverso la microscopia a due fotoni in vivo a doppio colore.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle cellule staminali tumorali, come il ruolo critico dell'interazione tra le cellule staminali del glioma e le cellule endoteliali vascolari e l'inizio del glioma in vivo, dimostrando che la procedura sarà sotto il responsabile lapier di JAK Surgical Services e postale nel mio laboratorio Per prepararsi all'intervento chirurgico in autoclave, Sterilizzare a vapore tutti gli strumenti chirurgici, compresa la punta del trapano dentale, dopo che il topo è stato anestetizzato con ketamina e xilazina e somministrato analgesia. Controllare il livello di anestesia eseguendo un pizzicamento delle dita dei piedi utilizzando un piccolo rasoio elettrico. Rimuovere il pelo dalla testa dorsale in un'area approssimativamente triangolare, circa tre millimetri, coccolare fino alle narici e estendendosi codardamente alle vertebre cervicali.

Applicare un unguento oftalmico sugli occhi. Posizionare il topo in posizione sdraiata ventrale e utilizzare iodio chirurgico seguito da etanolo al 70%. Per disinfettare la pelle, posizionare l'animale su un batuffolo di cotone e trasferirlo su un termoforo.

Per mantenere una temperatura corporea di circa 37 gradi Celsius, applicare un analgesico topico sul periostio e sui tessuti esposti della ferita. Utilizzando una lama di bisturi, rimuovere il periostio raschiando delicatamente il cranio. Questo aiuterà la colla cianoacrilica ad aderire all'osso.

Successivamente, usa un pennarello per delineare l'area corticale di interesse, assicurandoti di evitare le linee di sutura per evitare di danneggiare i grandi vasi sottostanti. Quindi applicare un sottile strato di adesivo cianoacrilato sui margini della ferita per prevenire l'infiltrazione di liquido sierosanguigno e sul cranio tranne che nell'area di interesse prima di sigillare il cranio con cemento dentale attivato dalla luce, trattare tutto il cranio esposto tranne l'area destinata al diradamento con primer e quindi agente legante. Una volta che l'agente legante si è asciugato, coprire il cranio con cemento dentale per stabilizzare la testa del topo.

Per la chirurgia e l'imaging, incorporare un dado esagonale 90 con trattino a doppio zero nel cemento dentale a una certa distanza dall'area da assottigliare. Una volta completata la preparazione del cemento dentale, utilizzare la luce visibile per polimerizzarlo. Quindi utilizzando un supporto a vite numero zero zero dash 90, un supporto per la testa dal dispositivo stereotassico al dado esagonale.

Quindi, posizionare la testa del topo sotto uno stereomicroscopio e applicare una goccia di soluzione fisiologica sterile allo 0,9% a temperatura ambiente sull'area del cranio da assottigliare. Usa un micro trapano ad alta velocità per assottigliare un'area circolare del cranio su una regione di interesse. Per evitare lesioni termiche al tessuto cerebrale sottostante, mettere in pausa a intermittenza la perforazione e applicare soluzione fisiologica.

Il cranio del topo comprende due strati sottili di osso compatto, a sandwich di uno spesso strato di osso spugnoso. Usa il trapano per rimuovere lo strato sottile superiore e la maggior parte dell'osso spugnoso. Dopo che la maggior parte dell'osso spugnoso è stata rimossa, le cavità rimanenti all'interno dell'osso spugnoso possono essere viste al microscopio da dissezione, indicando che la perforazione si sta avvicinando allo strato osseo compatto interno.

In questa fase, lo spessore del cranio dovrebbe essere ancora superiore a 50 micron. Continuare con cura il diradamento del cranio per ottenere una preparazione molto sottile e liscia. Per assottigliare ulteriormente il cranio, utilizzare una frusta di silicone su misura e una pasta diamantata per lucidarlo per circa 10 minuti.

Continua a lucidare il teschio con ossido di stagno a grana fine per altri 10 minuti. Usa la soluzione salina per eliminare l'ossido di stagno fino a quando il cranio sottile non appare pulito. Per eseguire un'iniezione, utilizzare un ago da siringa calibro 26 per creare una piccola apertura su un lato della finestra lucidata sotto il microscopio.

Utilizzare il micro manipolatore per abbassare la punta della pipetta attraverso il foro nella finestra cranica e nel cervello. Da 100 a 200 micron di profondità. Quindi iniettare un microlitro di sospensione cellulare a una velocità di 0,1 microlitri al minuto.

Dopo aver rimosso l'ago per sigillare la finestra cranica, asciugare il cranio e applicare una piccola goccia di colla cianoacrilica trasparente e un pezzo di tre millimetri. Numero uno, il vetrino coprioggetto. Utilizzare la colla cianoacrilica per sigillare lo spazio tra il vetrino coprioggetto e il cemento dentale adiacente.

Dopo l'intervento chirurgico, iniettare nel topo per via sottocutanea un millilitro di soluzione fisiologica sterile calda e fornire calore supplementare per mantenere la temperatura corporea fino a quando non si è completamente ripreso dall'anestesia. Somministrare iniezioni sottocutanee di analgesico ogni giorno per cinque giorni dopo l'intervento chirurgico e osservare il topo ogni giorno per assicurarsi che la ferita stia guarendo correttamente e che il topo stia mangiando, bevendo e comportandosi normalmente secondo l'immagine. Dopo aver anestetizzato il topo con ketamina e xilazina, immobilizzarlo utilizzando una cornice stereotassica personalizzata al microscopio.

Un intervento chirurgico di successo alla finestra cranica consente alla finestra cranica di rimanere libera per settimane o mesi. Questa figura mostra il sistema vascolare tra la finestra cranica di una porta come visualizzato utilizzando la luce retrodiffusa diffusa. Queste immagini vascolari sono state utilizzate come punti di riferimento per localizzare le stesse aree cerebrali per l'imaging ripetitivo.

Per visualizzare sia le cellule endoteliali vascolari che le cellule GBM, i topi sono stati generati con cellule endoteliali vascolari marcate con la proteina fluorescente rossa TD pomodoro. Dopo la procedura di craniotomia del porto, le cellule GBM marcate con GFP sono state iniettate nel loro cervello ed è stato eseguito l'imaging in vivo di due fotoni. Mostrato. Ecco un esempio in vivo di inizio del glioma da cellule GBM iniettate vicino al sistema vascolare.

Questa figura mostra la colorazione GFAP delle sezioni corticali di un topo senza intervento chirurgico di porto, di un topo sette giorni dopo l'intervento chirurgico di porto e di un topo sette giorni dopo l'intervento chirurgico di porto con iniezione di soluzione fisiologica. Dalle immagini è evidente che il topo senza intervento chirurgico e il topo con intervento chirurgico al port non hanno la gliosi. Mentre dopo l'iniezione di soluzione fisiologica, la gliosi si osserva nel tessuto cerebrale del topo a causa della penetrazione della pipetta e dell'iniezione di soluzione salina nel cervello.

Questo risultato dimostra che la gliosi non si verifica sotto la finestra cranica della porta. Fornire una convalida indipendente che la finestra cranica della porta qui descritta non porta alla gliosi che è tipicamente associata a una finestra cranica cronica del cranio aperto. Qui, l'imaging ad alta risoluzione delle spine dendritiche viene mostrato dallo stesso topo il giorno dell'intervento, il giorno zero e 32 giorni dopo la creazione della finestra della porta.

A dimostrazione del fatto che la finestra della porta è anche una scelta eccellente per l'imaging in vivo ad alta risoluzione. Dopo aver visto questo video, dovrebbe avere una buona comprensione di come visualizzare l'inizio del glioma iniettando cellule di glioblastoma attraverso uno smalto e rinforzare la finestra cranica.