提取组织抗原的功能分析

该程序的总体目标是制备与功能性免疫学测定相容的组织提取物。这是通过首先收集目标组织的样本来实现的。接下来，在丁醇、乙基、丁腈和水或 BAW 的混合物中匀浆组织样品。

确定蛋白质浓度后，分配提取物并冻干以去除溶剂。最终，重组的提取物被用作人 T 细胞增殖或细胞因子分泌测定中的抗原来源。与去污剂裂解等现有方法相比，该技术的主要优点是遗弃提取物不含有毒溶剂和去污剂。

在该协议中，所有人类材料都应被视为具有潜在传染性，并且所有程序都应在 2 类层流柜中进行。使用无菌剪刀和镊子，从大约 1 到 2 厘米大小的脾切片上去除脂肪和纤维组织。尽可能多地修剪掉外胶囊材料。

切下小块脾组织，将每块放入无菌的 50 毫升 Falcon 管 Snap 中。将组织块浸入液氮中冷冻，并储存在零下 80 摄氏度。开始准备用于储存培养的人类孔眼的程序。

CMRL 介质在 37 摄氏度下的孔眼。在 10 mL 锥形底管中收集孔眼，以 1， 500 RPM 的速度离心 5 分钟。丢弃培养基，第二次洗涤后在 PBS 中洗涤两次。

倒出 PBS，将倒置管短暂放在纸巾上，沥干残留的缓冲液。小心不要移开孔眼。排空后，重新盖上试管，在液氮中快速冷冻并储存在零下 80 摄氏度。

要制备组织提取物，首先，从零下 80 摄氏度和 T Thor 室温中取出含有组织的试管。组织将在丁醇、乙酰腈和水或 BAW 的混合物中匀浆，该混合物已预先制备并储存在 4 摄氏度。添加足够的冰冷 BAW 以覆盖本演示中使用的脾组织组织块，使用 10 至 20 毫升 BAW。

组装组织匀浆器。通过在水中均质化 20 毫升 70% 乙醇来清洁均质器。接下来，将匀浆器探针放入装有组织和 BAW 溶液的试管中，并多次匀浆组织。

此后将试管放在一个漂亮的桶中，以防止样品之间的组织交叉污染。将 10 至 20 毫升 70% 乙醇的水中匀浆，然后用 BAW 缓冲液离心机彻底清洁样品之间的均质器。在室温下匀浆的组织提取物。

如果需要仅包含可溶性物质的提取物，则以 4， 000 RPM 的速度旋转 10 分钟。如果需要更粗的提取物，离心后以 1000 RPM 离心 5 分钟，将旋囊转移到干净的试管中并置于冰上。随后使用 A BCA 或类似测定法测定提取物中蛋白质的浓度。

该方案中最重要的步骤是准确测量提取物中的蛋白质浓度，以便可以冻干适当体积的提取物。为了得到所需的蛋白质质量：要冷冻干燥提取物，首先根据所需的大量蛋白质稀释匀浆，然后将等分试样分配到标记的 5 毫升无菌管中。在本例中，每管分配 100 μg 蛋白质。

使用 18 至 20 号无菌针头在每根管的盖子上打三个孔，将管放在干冰上约 10 分钟以冷冻管，打开冷冻干燥机并使其平衡至零下 100 摄氏度。这大约需要 30 分钟。冻干机准备就绪后，将管子放入冻干机并打开真空泵。

根据提取物的体积，冷冻干燥可以在 3 小时内完成。尽管样品通常会放置过夜。干燥循环完成后，关闭真空泵并缓慢让压力进入腔室。

取下无菌罩中的试管架。从试管中取出穿孔盖，换上新盖。将试管存放在零下 20 摄氏度。

样品稍后可以在培养物、培养基或其他缓冲液中复溶，并用于生化测定功能。该图显示了载有脾眼、耗尽胰腺组织和纯化人孔提取物的蛋白质凝胶的染色。这些结果表明每个组织不同分子量的蛋白质具有良好的代表性，使用增殖测定测试了体式和胰岛提取物刺激人类 T 细胞增殖的能力，其中外周血单核细胞或 PBMC 用荧光染料标记 CFSE 细胞响应于抗原而增殖，导致 CFSE 强度降低直接通过流式细胞术测量。

本例中使用的 PBMC 是从 1 型糖尿病患者中分离出来的。C 细胞反应的大小表示为每 5， 000 CD 四个无抗原阳性 CCF SE 亮细胞的 CFSE 暗淡细胞数量与每 5， 000 CD 四个阳性 CCF SE 亮细胞的 CFSE 暗淡细胞数量之比，抗原来自一式三份样本。结果显示响应 Asana 的微弱但可检测到的增殖，细胞分裂指数或 CDI 为 3.5。

对 CDI 为 6.8 的孔眼提取物反应更强，灭活流感病毒作为阳性对照 在此程序之后。Ali Spot 或 e Iza 等其他方法可用于回答其他问题，例如响应组织衍生抗原分泌哪些细胞因子。