Name: 用肽:主要组织相容性复合物四聚体鉴定小鼠肺中的稀有抗原特异性 T 细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 学习使用肽:MHC四聚体技术从小鼠肺组织中分离和鉴定稀有抗原特异性T细胞的方法。该方案结合磁珠富集技术，可高效分析肺驻留T细胞在免疫耐受和免疫记忆中的作用。

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感谢 L. Kuhn 在组织处理和四聚体生产方面提供的技术支持。本研究由美国国立卫生研究院（R01 AI107020 和 P01 AI165072 资助 J.J.M.，T32 AI007512 资助 D.S.S.）、马萨诸塞州病原体应变能力联盟（J.J.M.）以及麻省总医院研究执行委员会（J.J.M.）提供经费支持。

本方案中描述的操作程序均根据麻省总医院机构动物照护与使用委员会（IACUC）制定的指南批准并制定，该委员会隶属于美国实验动物管理认证协会（AAALAC）认证的动物管理项目。实验所用动物为在麻省总医院动物设施中饲养并维持的8至12周龄雄性和雌性C57BL/6遗传背景小鼠，饲养环境为特定病原体-free条件。
1. 配制储备溶液
<ol>
	<li>通过溶解10 mM HEPES、5 mM KCl、1.8 mM CaCl2、150 mM NaCl和1 mM MgCl2配制HEPES缓冲液，并调节pH至7.4。</li>
	<li>通过将700 µg/mL的Liberase Thermolysin Medium（TM）（见材料表）溶解于含Ca++和Mg++的Hank's平衡盐溶液（见材料表）中，配制10倍浓度的Liberase储存液。</li>
	<li>通过将100 mM氨基胍半硫酸盐（Aminoguanidine Hemisulfate Salt）（见材料表）溶解于含Ca++和Mg++的Hank's平衡盐溶液（见材料表）中，配制10倍浓度的氨基胍储存液。</li>
	<li>通过将EHAA培养基（见材料表）与10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素/链霉素、50 µg/mL庆大霉素、2 mM L-谷氨酰胺和55 µM 2-巯基乙醇混合，配制完全Eagle's Ham's氨基酸（EHAA）培养基。 
	注：也可使用其他常见的T细胞培养基，如RPMI或DMEM。</li>
	<li>通过将1×PBS与2% FBS和0.05%叠氮化钠混合，配制分选缓冲液。</li>
	<li>将纯化的抗小鼠CD16/32抗体（见材料表）以1:100（v/v）的比例用分选缓冲液稀释，配制Fc阻断液。</li>
	<li>在不含L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基（见材料表）中加入100 µg/mL Liberase TM和50 µg/mL DNase I（见材料表），配制Liberase TM/DNase消化液。</li>
	<li>在生理盐水（0.9% NaCl）（见材料表）中加入10 mg/mL氯胺酮（ketamine）（见材料表）和1 mg/mL赛拉嗪（xylazine）（见材料表），配制氯胺酮/赛拉嗪混合液。</li>
</ol>
2. 通过自动化组织解离仪从肺组织制备单细胞悬液
<ol>
	<li>每只小鼠准备 4 mL 冰冷的 HEPES 缓冲液，置于专用组织解离管中（见材料表），并保持在冰上。</li>
	<li>通过腹腔注射 150–200 µL 氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉小鼠。将 1–3 µg 荧光染料标记的抗小鼠 CD45 抗体（见材料表）溶于 100 µL 生理盐水中，经静脉注射至每只麻醉后的小鼠体内。抗体注射后 3 分钟，通过腹腔注射 500–600 µL 氯胺酮/甲苯噻嗪混合物处死小鼠。</li>
	<li>切除肺组织，并将其放入预冷的专用组织解离管中。将解离管置于自动组织解离仪上（见材料表），运行针对肺组织的第一程序（预设程序）。</li>
	<li>向每根含有已解离肺组织的解离管中加入 500 µL Liberase 储存液和 500 µL 氨基胍储存液。在 37 °C 条件下，于旋转混匀仪中孵育 30 分钟。</li>
	<li>将解离管重新放回组织解离仪，运行针对肺组织的第二程序（预设程序）。</li>
	<li>将组织解离管中的单细胞悬液通过 100 µm 细胞滤网（见材料表）过滤至 50 mL 锥形管中。用 5 mL 完全 EHAA 培养基（或任何等效的 T 细胞培养基）冲洗组织解离管，并将冲洗液一并通过滤网收集至 50 mL 锥形管中。</li>
	<li>移除滤网，用完全 EHAA 培养基将细胞悬液体积补至 50 mL。在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 5 分钟。小心吸除上清液，保留约 100 µL 上清液及细胞沉淀。</li>
	<li>加入约 100 µL Fc 封闭液，使总体积达到 200 µL，然后剧烈涡旋振荡以充分重悬细胞沉淀。</li>
</ol>
3. 替代方案：通过手动解离法从肺组织制备单细胞悬液
<ol>
	<li>每只小鼠准备1 mL完全EHAA，置于1.5 mL离心管中，并置于冰上保存。</li>
	<li>通过腹腔注射150–200 µL氯胺酮/赛拉嗪混合物对小鼠进行麻醉。将1–3 µg荧光标记的抗小鼠CD45抗体溶于100 µL生理盐水中，经静脉注射至每只麻醉后的小鼠体内。在抗体注射后3分钟，通过腹腔注射500–600 µL氯胺酮/赛拉嗪混合物处死小鼠。</li>
	<li>切除肺组织，并将其放入预先置于冰上冷却的相应1.5 mL离心管中。</li>
	<li>待所有肺组织采集完成后，将每份肺组织转移至不含细胞培养基的新离心管中。</li>
	<li>在离心管内使用剪刀将肺组织剪成小片段（约2–3 mm大小）。</li>
	<li>向每根离心管中加入1 mL Liberase TM/DNase I消化液。</li>
	<li>在37 °C水浴中孵育30分钟。随后将样品放回冰上，以防止过度消化。</li>
	<li>将样品倒入置于50 mL锥形管上方的100 µm细胞筛中，使用无菌1 mL注射器活塞的橡胶端在筛网上碾压组织。</li>
	<li>用冷分选缓冲液冲洗细胞筛，最终收集7 mL液体至锥形管中。在4 °C条件下，以400 × g 离心5分钟。小心吸除上清液，保留约100 µL上清液及细胞沉淀。</li>
	<li>加入100 µL Fc阻断液，使总体积达到200 µL，然后剧烈涡旋振荡以充分重悬细胞沉淀。</li>
</ol>
4. 通过磁珠富集法富集肺组织样本中的T细胞
<ol>
	<li>加入 50 µL 抗小鼠 CD90.2 磁珠（参见 材料表）。涡旋混匀，并在 4 °C 下孵育 10 分钟。 
	注意：CD90.2 对应于 C57BL/6 小鼠 T 细胞表达的等位基因。若使用其他品系小鼠，请核对等位基因型。</li>
	<li>与此同时，将一个顺磁性细胞分离柱（参见 材料表）安装到单联或四联细胞分离磁架上（参见 材料表）。在每个分离柱下方放置一个开口的 15 mL 圆锥形离心管，用于收集穿流液。用 3 mL 冷分选缓冲液预冲洗分离柱，使液体依靠重力自然流至下方离心管中。</li>
	<li>细胞与磁珠孵育 10 分钟后，加入冷分选缓冲液至总体积为 1 mL，并通过置于分离柱顶部的 100 µm 细胞滤网转移样品。将分离柱的穿流液收集至位于其下方的新 15 mL 圆锥形离心管中。</li>
	<li>待细胞悬液完全依靠重力流尽后，用额外的 3 mL 冷分选缓冲液冲洗原先的离心管，并将冲洗液通过滤网加至分离柱，从而清洗滤网。随后移除滤网。</li>
	<li>当样品再次完全流入分离柱且无进一步穿流液流出时，将分离柱从磁架上取下，并置于一个新的 15 mL 圆锥形离心管上方。</li>
	<li>向分离柱中加入 5 mL 冷分选缓冲液。</li>
	<li>立即通过一次性连续推动分离柱活塞至顶部，将结合在柱上的细胞洗脱下来，迫使分选缓冲液从柱底部流入新离心管中。</li>
	<li>将洗脱后的样品在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟。小心吸除上清液，保留约 100 µL 上清液及细胞沉淀。</li>
	<li>加入 100 µL 冷分选缓冲液，使总体积达到 200 µL，并剧烈涡旋振荡以充分重悬细胞沉淀。</li>
	<li>如需分析，可对含有未结合细胞组分的穿流液样品进行检测。</li>
</ol>
5. 使用肽：MHC 四聚体染色抗原特异性T细胞
<ol>
	<li>向每个样本中加入 1 µL 的 10 µM Dasatinib（参见材料表），涡旋混匀，并在室温下孵育 5 分钟。</li>
	<li>加入 PE 或 APC 标记的肽：MHC 四聚体，使其终浓度为 10 nM（或根据经验优化的特定四聚体浓度）。</li>
	<li>涡旋混匀，在避光条件下于室温孵育 1 小时（或根据经验优化的时间和温度）。</li>
</ol>
6. 通过流式细胞术分析四聚体标记的T细胞
<ol>
	<li>在样本使用肽:MHC 四聚体染色的同时，配制用于染色细胞表面标志物的抗体主混合液（表1）。 
	​注意：避免使用与静脉注射的 CD45 抗体或四聚体产生荧光冲突的荧光染料。</li>
	<li>在四聚体染色孵育还剩 15 分钟时，向每份样本中加入按 1:100（或经经验优化的浓度）稀释的表面抗体主混合液。</li>
	<li>继续在室温下避光孵育，直至完成总共 1 小时的孵育时间。</li>
	<li>加入 50,000 个流式细胞术计数微球（见材料表），并加入冷分选缓冲液至终体积约 5 mL。将染色后的样本在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟。小心吸除上清液，保留约 100 µL 上清液以及细胞/微球沉淀。</li>
	<li>用额外的 200 µL 分选缓冲液重悬样本，并将样本转移至 5 mL 荧光激活细胞分选（FACS）管中。</li>
	<li>在流式细胞仪上分析样本。尽可能收集更多细胞，最多不超过总计 2,500,000 个事件。确保至少已收集到 20,000 个计数微球事件。保持采集速率在每秒 5,000 个事件或以下。</li>
	<li>将所有数据保存为 FCS 文件。</li>
</ol>
  
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>荧光染料</td>
			<td>抗体</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395</td>
			<td>CD90.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue</td>
			<td>CD45（通过静脉注射预先加入）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Orange</td>
			<td>CD8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 785</td>
			<td>CD4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC</td>
			<td>CD3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5</td>
			<td>排除标记（B220、CD11b、CD11c、F4/80）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE</td>
			<td>pMHC 四聚体或表型标记</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>表型标记（例如 CD44、PD-1、CD69 等）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC</td>
			<td>pMHC 四聚体或表型标记</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 700</td>
			<td>表型标记（例如 CD44、PD-1、CD69 等）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Cy7</td>
			<td>活/死染色</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：样本染色矩阵。 用于鉴定和表征抗原特异性T细胞的典型荧光素偶联流式细胞术抗体组合。
7. 数据分析
<ol>
	<li>使用适当的流式细胞术软件分析 FCS 数据文件。
	<ol>
		<li>设置一系列连续的包含门控，以鉴定以下事件：1）类似淋巴细胞的，2）单细胞的，3）活细胞，4）血管外，5）转储通道阴性，以及 6）CD90.2 阳性且同时为 CD4 或 CD8 阳性的细胞群（图 2）。</li>
		<li>在上述细胞群中鉴定四聚体阳性 T 细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过计算样本运行过程中加入的微球数（50,000）与实际采集到的微球数之比，并将该比值乘以采集到的四聚体阳性细胞总数，从而确定四聚体阳性细胞的绝对数量。 
	<img alt="四聚体分析方程，用于计算免疫学研究中四聚体阳性细胞总数的公式。" src="/files/ftp_upload/66939/66939eq01v2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 1"></li>
</ol>

Isolation and Characterization of Antigen-Specific T Cells in Mouse Lungs

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</ol>

作者声明无利益冲突。

既往对肺部抗原特异性T细胞的表征得益于急性初始刺激事件（如鼻内免疫或感染）后大量扩增的抗原特异性T细胞，从而提供了充足的细胞数量20,21,22。然而，肺部较为稀有的T细胞群体，例如自身抗原特异性T细胞或组织驻留记忆T细胞，在缺乏针对目标T细胞的某种样本富集手段时，难以被检测到15,16,23。我们通过结合先前描述的肺组织解离技术，以获得高比例的活淋巴细胞24,25，并整合一种区分血管内与实质T细胞的策略，以及基于T细胞的通用富集方法，随后进行四聚体染色17，实现了这一目标。利用本方案，我们已证明能够识别并表征肺中针对自身抗原的稀有T细胞，这些T细胞可由外源性肽段直接免疫或组织损伤过程中抗原释放所引发的间接激活而产生15,16。在本方案的开发过程中，考虑了多个关键因素。
我们介绍了两种效果良好的肺组织处理方案。一种方案使用自动组织解离仪器，另一种则依赖手动操作。重要的是，这两种方法均使用Liberase TM，这是一种胶原酶I和II的混合物，其中还含有金属蛋白酶嗜热菌蛋白酶。研究表明，与单一胶原酶混合物相比，该酶混合物可增强消化活性，并且在从肺组织中回收白细胞方面表现出良好效果26。
自动组织解离方案需要前期投入较高成本用于购买仪器和专用的组织解离管，但这些解离管可清洗后与细胞筛网一同重复使用，而细胞筛网通常也可重复使用。手动解离方案无需购置专用设备的前期投入，但耗时耗力，且由于每个样本需单独切割，延长了收获时间。两种方案在是否使用氨基胍或DNase I以减少细胞死亡和细胞聚集方面也存在差异，但我们尚未系统比较这些添加剂的影响。选择使用哪种方案应根据研究类型的操作经验以及是否具备自动组织解离仪器而定，其中仪器的可用性是成本方面的最主要因素。实际上，可将两种方案中的步骤灵活组合，以满足特定研究需求并实现最佳效果。
上述方案显著地省略了使用密度梯度法从组织解离所制备的单细胞悬液中分离淋巴细胞的步骤。我们发现，为鉴定稀有抗原特异性T细胞所需的磁珠富集T细胞步骤可省去此操作。然而，当抗原特异性T细胞频率足够高，足以完全省略T细胞富集步骤时，建议使用密度梯度法，因为该方法可通过去除大量非淋巴样细胞，实现目标细胞的显著富集。此外，如果肺组织单细胞制备物特别大量和/或含有较多杂质，则可在磁珠富集前采用密度梯度步骤，以去除可能堵塞后续分离柱的过量细胞碎片（步骤4.4–4.7）。
我们选择基于CD90泛T细胞标记物（在C57BL/6小鼠中表达的等位基因为CD90.2）对所有T细胞进行通用富集，而不是采用更直接的四聚体（tetramer）介导的细胞富集策略。该方法具有多项优势。（1）与未富集样本或基于四聚体的富集样本相比，基于CD90的富集在流式细胞术中可检测到更高数量的抗原特异性事件（图4）。这有助于更准确地估算稀有抗原特异性T细胞的频率，而无需采集过多的总事件数（&#62;2,500,000），从而避免延长样本采集时间并降低信噪比分辨率。（2）与基于四聚体的富集不同，基于CD90的富集可在同一样本中全面评估肺部T细胞区室，包括CD4+和CD8+ T细胞、血管内与血管外T细胞，以及抗原特异性与非抗原特异性T细胞（图2）。（3）由于基于CD90的富集步骤在四聚体染色之前进行，因此可最大限度缩短四聚体标记细胞在流式细胞仪上分析前的时间，从而减少因四聚体脱落导致的信号丢失风险。
本方案中的T细胞富集过程基于使用CD90.2磁珠的阳性选择法，但采用CD4、CD8或全T细胞分离试剂盒提供的阴性选择策略也可获得类似结果。我们描述了特定品牌的微珠、层析柱和磁铁的使用方法，但其他磁性富集系统同样适用。选择何种方法应基于具体研究中的实际表现以及总体成本，后者可能相当高昂。根据我们对富集方案的经验，目标细胞的得率与纯度之间通常存在权衡；而在检测极为稀少的抗原特异性T细胞时，优先考虑得率。
尽管代表性结果展示的是涉及CD4+ T细胞和肽段:MHC II类四聚体的实验，但本方案同样适用于CD8+ T细胞和肽段:MHC I类四聚体。在这些情况下，应考虑I类四聚体染色可能需要的不同条件（浓度、时间、温度）。此外，我们未发现任何理由排除将其用于抗原特异性B细胞研究，只需使用适当的荧光染料标记的B细胞抗原试剂即可27。
最后，本方案中还包括在四聚体染色前向样本中添加蛋白激酶抑制剂达沙替尼（Dasatinib）。达沙替尼可阻断T细胞受体（TCR）信号传导及内化过程，从而在改善T细胞四聚体标记的同时，可能减少四聚体诱导的T细胞死亡19。我们发现，达沙替尼处理在检测较稀有的自身抗原特异性T细胞群体时效果尤为显著。这很可能是因为，在中枢耐受过程中经历阴性选择后，自身抗原特异性T细胞表达的TCR亲和力较低28,29,30,31。
本实验方案已成功与细胞内染色技术联用，用于分析稀有肺驻留抗原特异性T细胞中转录因子和细胞因子的表达。我们还成功对这些稀有细胞群进行了流式分选，用于后续分析，包括单细胞转录组学和TCR测序。该方案的持续应用与优化将极大促进肺部病理生理过程中适应性免疫的研究。

适应性免疫系统的核心在于T细胞识别并响应特定抗原的能力。T细胞在何时何地响应其同源抗原，决定了感染与自身免疫、稳态与癌症、健康与疾病之间的平衡1。因此，在特定免疫背景下研究T细胞时，应重点关注针对相关目标抗原具有特异性的T细胞。在诸多技术进步中，荧光标记的可溶性多聚体（通常为四聚体）显著增强了对抗原特异性T细胞群体的表征能力，这类多聚体由主要组织相容性复合物（MHC）I类或II类分子与抗原肽表位结合而成，通常被称为“肽-MHC四聚体”2,3,4,5。由于肽-MHC I类和II类四聚体代表了T细胞抗原受体（TCR）的天然配体，因此可分别用于直接识别免疫系统内源性T细胞库中的抗原特异性CD8+和CD4+ T细胞，而无需依赖实验中抗原刺激后的应答反应。相较于TCR转基因T细胞过继转移模型，四聚体技术为研究抗原特异性T细胞提供了更为精确的方法6，并已越来越多地应用于实验小鼠模型及人类疾病中，用于鉴定针对外来抗原和自身抗原的T细胞群体4,5。
虽然四聚体能够轻易鉴定出因抗原刺激而扩增的高频T细胞群体，但其在初始T细胞、自身抗原特异性T细胞或记忆T细胞研究中的应用受到这些细胞群体极低频率的限制7。我们课题组及其他研究团队已开发并推广了基于四聚体的磁性富集策略，该方法提高了检测灵敏度，使得在小鼠淋巴组织中对这些细胞群体的研究成为可能8,9,10,11。
组织驻留性T细胞的发现使研究领域更加重视开发新方法来探究非淋巴组织空间中的T细胞。与其他许多黏膜表面类似，肺部的T细胞会接触到一系列来源于宿主上皮、共生及致病微生物以及环境成分（包括过敏原）的自身和外来抗原。从非淋巴组织（NLT）中分离出的T细胞的转录组分析显示其具有类似记忆表型的特征，并表现出独特的组织特异性命运和功能，通常与迁移及组织稳态相关12。此外，组织驻留记忆T细胞（Trms）相较于循环中的T细胞通常具有更严格的克隆限制性13。明确抗原如何以及为何驱动T细胞在NLT中驻留，对于理解免疫系统如何抵御感染、维持组织稳态，以及在某些情况下如何演变为自身免疫反应至关重要。然而，肺部组织驻留性T细胞的损耗似乎比其他NLT更为显著14。因此，识别和表征具有特定抗原反应性的内源性肺T细胞的能力受到其本身稀有性的限制。
通过结合使用磁珠介导的细胞富集技术和肽：MHC 四聚体染色方法，我们成功检测到小鼠肺组织中数量扩增但极为稀有的自身抗原特异性 T 细胞15,16. 本文详细描述了一种经过我们优化的实验方案，可稳定地分离和鉴定小鼠肺组织中任何稀有的抗原特异性T细胞群体（图1）。该方案包含一个 体内 抗体染色步骤以区分组织驻留性T细胞与血管内T细胞17 随后采用两种不同的肺组织处理方法，以适应不同资源条件。接着进行通用的T细胞磁珠富集、四聚体染色及流式细胞术分析。本方案通过添加氨基胍以阻断诱导型一氧化氮合酶（iNOS）介导的T细胞活化诱导的凋亡，进一步提高细胞活力和四聚体染色效果18 以及限制TCR下调的达沙替尼19本方案中强调的步骤采用了常见的技术与 readily available 试剂，几乎任何从事小鼠 T 细胞免疫学研究的研究人员均可使用，并且高度适用于多种下游分析。尽管初始 T 细胞不太可能在肺组织中被发现，但我们认为本方案对于研究肺部自身抗原特异性 T 细胞及组织驻留记忆 T 细胞（Trms）将特别有帮助。
<img alt="小鼠肺细胞分离：示意图、离心机设置、单细胞悬液、流式细胞术分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66939/66939fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：实验方案流程概览。 从小鼠中取出肺组织并解离为单细胞。样品随后进行T细胞富集，再使用肽：MHC四聚体及荧光标记抗体染色，用于流式细胞术分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66939/66939fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>100 mm 细胞筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt; 或 Mg&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt; 的 10x PBS</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt; 或 Mg&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt; 的 1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>AccuCheck 计数微球</td><td>Invitrogen</td><td>PCB100</td><td></td></tr><tr><td>氨基胍半硫酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7009</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 CD90.2 磁珠</td><td>Miltenyi</td><td>130-121-278</td><td></td></tr><tr><td>细胞分离磁铁（MidiMACS 分离器）</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-302</td><td>可容纳单个 LS 柱</td></tr><tr><td>细胞分离磁铁（QuadroMACS 分离器）</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-976</td><td>可容纳 4 个 LS 柱</td></tr><tr><td>达沙替尼</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS023389</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Eagle&amp;rsquo;s Ham&amp;rsquo;s 氨基酸培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5572</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-235</td><td>自动化组织解离仪</td></tr><tr><td>gentleMACS C 管</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-237</td><td>自动化组织解离仪专用管</td></tr><tr><td>含 Ca&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt; 或 Mg&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt; 的 Hank's 平衡盐溶液</td><td>Corning</td><td>21-020-CM</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-996-06</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue 标记的抗小鼠 CD45 抗体（克隆：30-F11）</td><td>Biolegend</td><td>103126</td><td></td></tr><tr><td>磁性细胞分离柱（LS 柱）</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td>配有推杆</td></tr><tr><td>纯化的抗小鼠 CD16/32 抗体（克隆：93）</td><td>Biolegend</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>不含 L-谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基</td><td>Corning</td><td>15-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠（生理盐水）</td><td>Cytiva</td><td>Z1376</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Pivetal</td><td>NDC 466066-750-02</td><td></td></tr></tbody></table>

利用肽：主要组织相容性复合体四聚体鉴定小鼠肺中稀有抗原特异性t细胞

Identification of Rare Antigen-Specific T Cells from Mouse Lungs with Peptide:Major Histocompatibility Complex Tetramers

在健康与疾病状态下对抗原特异性T细胞的鉴定与表征，仍是深化免疫病理生理学理解的关键。针对在内源性T细胞库中追踪抗原特异性T细胞群体的技术难题，肽：MHC四聚体试剂的开发已带来显著进展。这些荧光标记的可溶性多聚体由MHC I类或II类分子与抗原肽表位复合而成，能够直接结合具有相应T细胞受体（TCR）特异性的T细胞，从而可在无需诱导功能性反应的情况下，识别处于天然状态的抗原特异性T细胞群体。 离体 刺激。对于极为稀有的细胞群体，可通过磁珠富集四聚体结合的T细胞，以提高检测的灵敏度和可靠性。
随着对组织驻留性T细胞免疫研究的不断深入，迫切需要鉴定那些迁移并驻留在非淋巴组织中的抗原特异性T细胞。本实验方案详细介绍了从小鼠肺组织中分离和鉴定抗原特异性T细胞的具体步骤。该方法包括从消化后的肺组织中分离T细胞，随后进行通用T细胞磁珠富集，再通过四聚体染色进行流式细胞术分析与分选。本方案所强调的步骤采用常规实验技术和易于获取的试剂，几乎适用于所有从事小鼠T细胞免疫学研究的研究人员，并且可高度适应于肺内任何低频率抗原特异性T细胞群体的多种下游分析。

图2展示了利用肽:MHC II类四聚体鉴定肺中稀有抗原特异性CD4+ T细胞的代表性设门策略。相同的方法也可用于通过肽:MHC I类四聚体鉴定抗原特异性CD8+ T细胞（数据未显示）。
由于肺组织中含有大量非淋巴细胞，通过四聚体技术可靠地检测稀有抗原特异性T细胞需要对目标T细胞进行某种形式的预先富集，以提高信噪比。图3展示了本方案中所述基于CD90.2抗体的磁珠富集肺组织总T细胞的效果。通过该富集方法，我们平均可回收肺中超过99%的CD90.2+ T细胞，且纯度超过90%。图4展示了经此富集后，稀有四聚体阳性CD4+ T细胞的检测灵敏度显著提高，相较于未富集样本或直接采用四聚体为基础的细胞富集策略更为有效。
图5展示了经达沙替尼处理后抗原特异性T细胞的四聚体标记效果得到改善，尤其是在稀有细胞群中更为明显。
<img alt="流式细胞术设门策略示意图，用于鉴定淋巴细胞、T细胞、CD4、CD8及四聚体阳性细胞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66939/66939fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：流式细胞术分析的设门策略。 通过连续的圈选与排除设门，鉴定在急性组织损伤后积聚于肺部的稀有自身抗原特异性CD4+ T细胞。计数微球可根据其在FITC通道中的荧光信号直接识别。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66939/66939fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肺部T细胞富集、流式细胞术、散点图、CD90.2 对 Dump、未结合组与结合组。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66939/66939fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：基于CD90.2抗体的磁珠富集法从肺组织中富集总T细胞。图中显示了肺组织样本经富集后，未结合组（左）和结合组（右）的代表性流式细胞术散点图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66939/66939fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="CD44与四聚体染色的流式细胞术图示；显示细胞富集结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66939/66939fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：比较不同细胞富集策略以提高肺组织中稀有抗原特异性T细胞的检出率。三只在肺上皮细胞中表达模型自身抗原的小鼠，通过皮下注射用完全弗氏佐剂（CFA）乳化的自身抗原肽段表位进行免疫。7天后，收集小鼠肺组织并合并，随后均分为三份样本，分别不进行细胞富集（左）、采用CD90.2抗体进行细胞富集（中）或采用四聚体进行细胞富集（右），然后进行四聚体染色。所有样本通过流式细胞术分析，总事件数不超过1,500,000个（显示CD4+门控事件）。四聚体阳性事件数以黑色标注，而肺组织样本中抗原特异性T细胞的计算总数以红色标注。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66939/66939fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术直方图；达沙替尼对野生型与CC10-USA小鼠中Tet耐药性的影响" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66939/66939fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：达沙替尼处理增强四聚体染色。 将野生型小鼠（左）或在肺上皮中表达模型自身抗原的小鼠（右）通过皮下注射方式免疫，注射物为来自自身抗原的肽段表位，并以CFA乳化。收集小鼠的脾脏和淋巴器官，合并后均分为两份样本，分别用于肽-MHC II类四聚体染色，其中一份在染色前经达沙替尼预处理。图中叠加显示了经达沙替尼处理（红色）与未处理（蓝色）样本的四聚体染色直方图，每份样本的中位荧光强度已标出。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66939/66939fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们提供了一种详细的实验方案，通过磁珠法富集T细胞结合肽：主要组织相容性复合体（MHC）四聚体技术，从小鼠肺组织中分离并鉴定稀有的抗原特异性T细胞群体。

利用肽：主要组织相容性复合体四聚体鉴定小鼠肺中稀有抗原特异性T细胞

健康与疾病状态下抗原特异性T细胞的鉴定与表征仍是深化免疫学认知的关键……

我们的实验室研究在不同耐受与免疫背景下CD4 T细胞的发育过程。在各项研究中，我们主要关注抗原暴露如何驱动T细胞表型亚群的发育，从而形成免疫记忆，以增强对自身抗原的耐受性或对病原体的免疫应答。近期，我们的研究重点集中在定位于肺组织中的调节性T细胞和记忆性T细胞亚群的发育过程。这些组织驻留性T细胞在组织损伤期间对细胞抗原维持耐受性，或在再次感染时促进针对病原体的炎症反应中发挥重要作用。本实验室专注于抗原特异性T细胞的直接研究，使用定制的肽-MHC四聚体试剂。这使得我们能够在不依赖TCR转基因模型或其他已知可能引起实验假象的操作的情况下研究这些T细胞。尽管我们可以利用四聚体直接鉴定抗原特异性T细胞，但这类T细胞通常频率极低，尤其是在处于初始或记忆状态时。此外，在免疫应答后，这些T细胞常驻留于非淋巴组织中，从中分离也颇具挑战性。虽然目前已有一些从小鼠肺组织中分离T细胞的成熟方案，但本文所介绍的方案已针对后续通过四聚体染色检测低频率抗原特异性T细胞进行了优化。本方案中，我们还提供了两种组织解离方法，以更好地适应活体资源的需求。本方案将帮助研究人员扩展四聚体技术的应用，用于研究肺组织中的抗原特异性T细胞。这将推动对组织驻留记忆T细胞发育与功能更加强大的体内研究，而这些正是当前领域内备受关注的重要课题。将一至三毫克荧光染料标记的抗小鼠 CD45 抗体溶于 100 毫升生理盐水中，静脉注射至每只麻醉小鼠体内。首先，为每只小鼠准备含有 4 毫升冰上预冷的 HEPES 缓冲液的专用组织解离管，并置于冰上。处死小鼠后，立即将切除的肺组织放入对应编号的、预先冰浴冷却的组织解离管中。将试管放入自动组织解离仪中，并运行针对肺组织的第一个预设程序。然后向每支含有解离肺组织的试管中加入500 µL Liberase储存液和500 µL氨基胍储存液。在37°C条件下，于振荡混合器上孵育30分钟。随后，将试管重新放回解离仪上，运行针对肺组织的第二个预设程序。接着，将组织解离管中的单细胞悬液通过100 µm细胞滤筛倒入50 mL锥形管中。用5 mL完全EHAA冲洗组织解离管，并将冲洗液经滤筛滤入50 mL试管中。去除滤网后，用完全EHAA将细胞悬液的体积调至50毫升。无需使用专用的组织解离管，将切除的肺组织分别放入预冷的冰上放置的1.5毫升微量离心管中。待所有肺组织采集完毕后，将每份肺组织转移至不含任何细胞培养基的新微量离心管中。使用剪刀在微量离心管内将肺组织剪成小片段。向每根试管中加入1毫升Liberase TM和DNase I消化液。在37摄氏度水浴中孵育30分钟。然后将样品倒入置于50毫升锥形管上方的100微米细胞滤筛中。用移液器将剩余样品转移至滤筛上。使用无菌1毫升注射器推杆的橡胶端在滤膜上研磨组织。用冷分选缓冲液冲洗滤网，最终在离心管中收集七毫升液体。无论采用自动还是手动解离方法，均需离心所获得的细胞悬液。小心吸除上清液，保留约100微升上清液及细胞沉淀。最后，加入约100微升FC阻断液，使总体积达到200微升，并剧烈涡旋振荡以重悬细胞沉淀。首先，向分离的肺细胞中加入50微升抗小鼠CD90.2微珠。涡旋混匀后，在4摄氏度条件下孵育10分钟。接下来，将一个磁性细胞分离柱置于单孔或四孔细胞分离磁铁上。在每个分离柱下方放置一个开口的15毫升锥形管，用于收集流穿液。用3毫升冷的分选缓冲液预处理分离柱，使缓冲液依靠重力自然流过柱体进入下方的锥形管。细胞与微珠孵育10分钟后，加入冷分选缓冲液至1毫升体积，并将混合液通过置于柱子上方的100微米细胞筛网过滤。将柱子的流出液收集到柱子下方放置的新的15毫升锥形管中。待细胞悬液完全流尽后，向原始试管中再加入3毫升冷分选缓冲液，并通过筛网将其加至柱子中，然后移除筛网。当样品完全流穿进入柱子且无液体继续流出时，将柱子从磁铁上取下，并置于新的15毫升锥形管上。向柱子中加入5毫升冷分选缓冲液。为洗脱结合的细胞，将柱塞连续向下推动一次，使缓冲液从底部压出至新管中。将洗脱的样品在4°C下以400 × g离心五分钟。小心吸去上清液，保留约100微升上清液以及细胞沉淀。平均而言，富集过程可从肺组织中回收超过99%的CD90.2+ T细胞，纯度超过90%。在对肺组织样本进行T细胞富集后，向每个样本中加入1毫升10毫摩尔的达沙替尼。涡旋混匀后，在室温下孵育5分钟。加入PE或APC标记的肽-MHC四聚体，使其终浓度为10纳摩尔。涡旋混合后，将混合物在室温下避光孵育一小时。在样本用肽-MHC 四聚体染色的同时，配制用于染色细胞表面标志物的抗体主混合液。在四聚体染色孵育期还剩15分钟时，按1:100的稀释比例加入表面抗体主混合液。加入 50,000 个流式细胞术计数微球及冷分选缓冲液，使终体积约为五毫升。然后加入冷分选缓冲液至 15 毫升体积，并在 4 摄氏度下以 400 × g 离心五分钟。小心吸除上清液，保留约 100 微升上清液及细胞沉淀。现在用额外的 200 微升分选缓冲液重悬样本，并将其转移至一个 5 毫升 FACS 管中。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

用肽:主要组织相容性复合物四聚体鉴定小鼠肺中的稀有抗原特异性 T 细胞

本实验展示了从全外周血中纯化并体外扩增抗原特异性CD4+ T细胞，以及利用MHC II类四聚体对其进行可视化检测的方法。四聚体技术能够直接可视化具有单一抗原特性和明确MHC...

使用MHC II类四聚体可视化抗原特异性CD4+ T细胞

本方案描述了使用多肽:MHC 四聚体和磁性微珠分离低频表位特异性T细胞群体，并通过流式细胞术对其进行分析的方法。该方法可实现对内源性特定T细胞群体的直接研究 在体...

基于肽段-MHC四聚体的表位特异性T细胞富集

本视频展示了一种利用肽-主要组织相容性复合物I类（pMHC-I）四聚体来表征特异性针对猴免疫缺陷病毒（SIV）的CD8+记忆T细胞的方法。pMHC-I四聚体是由四个MHC-I分子与SIV特异性肽段结合并偶联荧光染料所形成的复合物。这些四聚体可特异性地结合SIV特异性的CD8+...

一种用于分析SIV特异性CD8+记忆T细胞的肽-MHC-I四聚体染色技术

通过主要组织相容性复合体II类右旋糖酐微球直接染色检测脑和心脏中自身反应性CD4 T细胞的方案已在本报告中描述。为实现全面分析，需采用一种可靠的方法来定量抗原特异性CD4+ T细胞 原位...

原位检测脑和心脏中使用主要组织相容性复合物II类右旋糖酐微球的自身反应性CD4 T细胞

本文介绍了一种用于产生和扩增特异性针对特定同种异体抗原的人T细胞克隆的方法。该方案可经调整后用于克隆针对多种肽-MHC复合物配体的特异性人T细胞。...

从外周血中生成人同种异体抗原特异性T细胞

本文介绍了一种优化的实验方案，用于计数和表征恒河猴抗艾滋病病毒的CD8+ T细胞。该文章不仅对HIV免疫学领域具有重要价值，也适用于其他已知CD8+...

通过肽-MHC-I 四聚体染色法分析恒河猴中猴免疫缺陷病毒特异性 CD8+ T 细胞

此处，我们介绍一种结合了 原位 使用MHC四聚体染色结合免疫组织化学技术确定组织中抗原特异性T细胞的定位、表型及数量。该方案用于分析抗原特异性CD8 T细胞在组织中相对于其他细胞类型和结构的空间分布及表型特征。...

原位 MHC-四聚体染色及定量分析以确定组织中抗原特异性CD8 T细胞的位置、丰度和表型

本文介绍了一种用于体外定性检测抗原特异性CD8+...

通过MHC I类四聚体染色法在病毒载体疫苗接种后同时定量抗载体和抗转基因特异性CD8+ T细胞

本文介绍了一种用于生成抗原特异性CD8...

用于自身免疫性糖尿病模型功能检测的高效生成抗原特异性原代小鼠细胞毒性T细胞

本文介绍了一种从小鼠和人类细胞系中纯化MHC...

免疫肽组学：小鼠和人类MHC I类和II类相关肽段的分离及其质谱分析

学习使用肽:MHC四聚体技术从小鼠肺组织中分离和鉴定稀有抗原特异性T细胞的方法。该方案结合磁珠富集技术，可高效分析肺驻留T细胞在免疫耐受和免疫记忆中的作用。

利用肽：主要组织相容性复合体四聚体鉴定小鼠肺中稀有抗原特异性T细胞

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