펩타이드 : 에피토프 특정 T 세포의 MHC Tetramer 기반 강화

다음 실험의 전반적인 목표는 마우스의 내인성 T 세포 레퍼토리에서 희귀 에피토프 특이적 T 세포를 식별하는 것입니다. 이는 먼저 수확된 림프구 세포를 펩타이드 MHC 사합체 시약으로 염색하여 달성되며, 이 시약은 관련 항원결정기 특이적 T 세포를 형광 라벨링합니다. 그런 다음 이러한 사량체로 표지된 세포는 사량체의 형광 태그에 특이적인 항체에 접합된 자기 마이크로비드로 염색됩니다.

다음으로, 자기적으로 표지된 세포는 사량체 결합 에피토프 특이적 T 세포에 대한 샘플을 농축하기 위해 자화된 컬럼을 통과합니다. 마지막으로, 원하는 실험용 세포 마커를 위해 세포를 염색하고 다중 매개변수 유세포 분석을 수행하여 희귀 사량체가 풍부한 항원결정기 특이적 T 세포 집단을 검출하고 정량화합니다. TCR 형질전환 T세포 입양 전달 시스템과 같은 다른 기존 방법에 비해 이 기술을 사용하는 주요 이점은 면역 체계 내에서 자연적으로 발달하는 항원결정기 특이적 T 세포의 실제 다클론 집단에 대한 연구가 수행된다는 것입니다.

또한, 이 기술이 제공하는 높은 검출 감도는 극도로 낮은 빈도로 존재하는 이러한 집단에 대한 연구를 가능하게 합니다. 이 방법은 병원성 미생물의 주어진 항원을 얼마나 많은 미성숙 T 세포가 인식할 수 있는지, 항원결정기 특이적 T 세포 집단의 클론 구성이 면역 반응 과정에서 어떻게 변하는지와 같은 면역학 분야의 많은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 해부를 시작하기 전에 100미크론 나일론 메쉬의 작은 정사각형이 들어 있는 60mm 배양 접시에 완전한 EHAA 배지 1ml를 넣고 접시를 얼음 위에 놓습니다.

그런 다음 안락사된 쥐의 비장과 쉽게 접근할 수 있는 림프절을 가능한 한 많이 제거합니다. 배양 접시의 나일론 메쉬 위에 티슈를 놓습니다. 닫힌 1.5mm 마이크로 퍼지 튜브의 평평한 상단을 사용하여 나일론 메쉬의 림프 조직을 부드럽게 으깨십시오.

림프구를 방출하려면 접시에 또 다른 밀리리터의 배지를 추가한 다음 용액을 위아래로 피펫으로 만들어 세포를 현탁액으로 작동시킵니다. 이제 새로운 15ml 폴리프로필렌 원심분리기 튜브 위에 새 나일론 메쉬를 놓고 새 메쉬를 통해 셀을 옮깁니다. 접시를 헹구고 또 다른 밀리리터의 차가운 매체로 메쉬를 헹구고 새 메쉬 조각을 통해 볼륨을 15ml 튜브로 당깁니다.

헹굼을 한 번 더 반복합니다. 최종 부피 15ml에 냉간 선별기 버퍼를 추가한 후 G 300배, 섭씨 4도에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 그런 다음 조심스럽게 snat resus를 흡인합니다.

FC 블록의 셀 펠릿을 펠릿 자체의 약 2배와 동일한 최종 부피로 현탁합니다. 많은 정도의 세포 응집이 발생한 경우. 피펫 팁으로 세포 덩어리를 조심스럽게 제거하여 항원 특이 T 세포를 염색합니다.

형광 표지된 펩타이드 MHC 테트라머를 최적화된 농도로 재현탁 세포 펠릿에 첨가합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 혼합하고 사합체 결합을 위해 최적화된 시간과 온도에서 배양합니다. 다음으로, 콜드 소터 버퍼를 추가하여 부피를 최대 15ml까지 가져오고 원심분리기를 통해 셀을 섭씨 4도로 유지합니다.

이제부터 상층액을 조심스럽게 흡인하십시오. 그런 다음 세포 펠릿을 분류기 완충액에 200마이크로리터의 최종 부피로 재현탁합니다. 이제 tetramer mix의 형광 태그에 특이적으로 결합할 mil tenny antibody conjugated microbeads 50μl를 추가한 다음 tetramer 결합 세포와 비드를 섭씨 4도에서 배양합니다.

20분 후, 세포가 원심분리기에 있는 동안 분류기 버퍼에서 세포를 세척합니다. quadro max 자석에 milani LS 마그네틱 컬럼을 놓고 새로운 15ml 폴리프로필렌 원심분리기 튜브를 배치합니다. 컬럼 바로 아래에 3ml의 분류기 버퍼를 컬럼 상단에 추가하여 15ml 튜브로 배출되도록 합니다.

그런 다음 컬럼 위에 100미크론 나일론 메쉬 사각형을 놓습니다. 세포가 회전을 마치면 상등액을 조심스럽게 흡인하고 펠릿을 3ml의 분류기 완충액에 재현탁시키고 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 컬럼 상단으로 옮깁니다. 셀 현탁액이 컬럼으로 완전히 배출되면 원래 튜브를 또 다른 3ml의 분류기 버퍼로 헹구고 메쉬를 통해 컬럼으로 옮깁니다.

세척액을 수집 튜브에 모으고 나일론 메쉬를 버립니다. 그런 다음 버퍼가 튜브로 완전히 배출되면 매번 3ml의 분류기 버퍼로 컬럼을 두 번 더 세척합니다. 그런 다음 자석에서 컬럼을 제거하고 새 15ml 폴리프로필렌 원심분리기 튜브 위에 컬럼을 놓습니다.

이제 열에 5밀리리터의 분류기 버퍼를 더 추가합니다. 즉시 플런저를 컬럼 상단에 삽입하고 한 번의 연속 동작으로 플런저를 끝까지 밀어 버퍼를 컬럼에서 튜브로 밀어 넣습니다. 회피된 결합 분획을 포함하는 튜브와 결합되지 않은 분획을 통한 흐름을 포함하는 튜브를 모두 회전시킨 후, 결합된 분획에서 상등액을 조심스럽게 흡입하고 분류기 완충액의 세포 펠릿을 정확히 95마이크로리터의 최종 부피로 재현탁하고, 세포 분획을 추가로 염색하기 전에 결합되지 않은 분획을 2밀리리터의 최종 부피로 흡인 및 재현탁합니다. 200마이크로리터의 계수 비드를 5밀리리터 팩스 튜브에 넣고 5마이크로리터의 셀을 이 튜브로 옮깁니다.

분석을 위해 이 튜브를 섭씨 4도로 따로 보관하십시오. 나중에 항체의 마스터 믹스를 결합하여 표에 따라 세포의 표면 마커를 염색합니다. 결합된 분획의 경우, 결합되지 않은 분획에 대한 세포에 직접 항체 칵테일 용량을 추가합니다.

90마이크로리터의 세포를 5밀리리터 팩스 튜브로 옮기고 사용할 각 형광 색소에 대해 옮겨진 샘플에 항체 칵테일을 추가합니다. 50마이크로리터의 세포의 결합되지 않은 남은 분획을 5밀리리터 팩스 튜브에 적절한 형광 색소에 접합된 1마이크로리터의 안티 CD 4 항체와 혼합합니다. 염색되지 않은 대조군과 다음 소용돌이를 따로 보관한 다음 모든 샘플을 섭씨 4도에서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 각 튜브를 5ml의 분류기 완충액으로 세척한 후 결합된 분획 샘플에서 상등액을 조심스럽게 흡인하고 200마이크로리터의 선별기 완충액에 세포를 재현탁합니다. 세포를 1.2밀리리터로 옮기고 마이크로 튜브를 팩스로 보낸 다음 다른 200마이크로리터의 분류기 버퍼로 이전 튜브를 헹구고 헹굼을 해당 마이크로 튜브에 모읍니다. 덩어리가 분명한 경우, 결합되지 않은 분획 및 보상 제어를 위해 50미크론 필터를 통해 세포를 통과시키고, 상층액을 디캔팅한 다음 펠릿을 1ml의 분류기 완충액에 다시 현탁시킵니다.

결합된 분획 샘플에 대해 여기에 설명된 대로 CD 4개의 양성 또는 CD 8개의 양성 T 세포를 식별하기 위해 연속적인 포함 게이트의 순서를 사용하여 염색된 샘플을 분석합니다. 결합되지 않은 분획 샘플에 대해 최대 총 200만 개의 이벤트까지 가능한 한 많은 세포를 수집합니다. 총 100만 개의 이벤트를 수집하세요.

마지막으로, 동일한 기계 설정을 사용하여 계수 비드 샘플에서 10, 000개의 이벤트를 수집합니다. 이 첫 번째 그림은 결합 및 결합되지 않은 세포 분획에 대한 미성숙 마우스의 펩타이드 MHC, 2개의 사량체가 풍부한 비장 및 림프절 샘플의 대표적인 유세포 분석 플롯을 보여줍니다. 항원결정기 특이적 T 세포 또는 배경 염색의 분석을 위해 림프 산란, 낮은 덤프 음성 CD를 가진 양성 측면 산란, CD 중 3개의 양성 반응, 4개의 양성 또는 CD 8개의 양성 반응을 선택하기 위해 게이트의 연속을 설정했습니다.

결합된 분획 및 결합되지 않은 분획으로부터 염색되지 않은 세포의 분취액을 형광 계수 비드와 혼합하고 별도로 분석하였다. 이러한 밀도 플롯은 이전에 관련 펩타이드와 완전 보조제로 면역된 마우스에 대한 대표 데이터를 보여줍니다. 이전 실험에서와 동일한 직렬 게이팅 전략을 사용하여 자가형광 및 기타 원치 않는 이벤트를 제거했습니다.

CD 4개의 양성 T 세포 집단의 분석에서, CD 8개의 양성 T 세포 집단은 CD 4개의 양성 T 세포의 펩타이드 MHC 2개의 사량체 염색에 대한 유용한 내부 음성 대조군 역할을 했습니다. 샘플 내 에피토프 특이적 T 세포의 절대 수는 비드 개수 분석에서 결정된 농축 샘플의 결합 분획에 있는 모든 세포의 총 수와 첫 번째 일련의 밀도 플롯에 표시된 대표적인 나이브 마우스 데이터에 대한 세포 염색 분석에서 결정된 테트라머 양성 세포의 비율을 곱하여 계산됩니다. 총 세포 수는 4, 411이었고 비드 수는 5, 589였습니다. 비드 스톡 농도는 밀리리터당 5분의 2 10의 2배였습니다.

비드 부피는 0.2 밀리리터이고 세포 부피는 0.005 밀리리터였다. 따라서, 이러한 데이터는 6.31 곱하기 10에서 밀리리터당 6분의 1의 세포 농도를 생성하는 데 사용되었습니다. 그런 다음 세포 농도에 총 샘플 부피를 곱하여 총 세포 수를 생성했습니다.

이 데이터에 세포 분석에서 나온 사합체 양성 반응의 퍼센트를 곱하여 이 순진한 마우스에서 나온 4개의 양성 T 세포가 98개임을 알아냈습니다. 밀도 플롯의 두 번째 시리즈에서 대표적인 면역된 마우스 데이터의 경우, 4개의 양성 T 세포인 항원결정기 특이적 CD의 총 수는 1.53 곱하기 10에서 4번째였습니다. 농축의 효율은 항원결정기 특이적 T 세포의 수가 증가함에 따라 감소합니다.

따라서 사량체 양성 세포는 매우 높은 빈도의 항원결정기 특이적 T 세포를 포함하는 샘플의 결합되지 않은 분획에서 볼 수 있습니다. 이러한 경우, 결합되지 않은 분획물에 존재하는 항원결정기 특이적 T 세포의 수를 별도로 계산하여 결합된 분획에서 발견되는 수에 추가할 수 있습니다. 예를 들어, 대표적인 면역된 마우스 unbound cell fraction에서, epitope specific CD 4개의 positive T cell의 총 수는 8.97 곱하기 10 대 3이었다.

따라서, 결합 및 결합되지 않은 분획의 숫자를 더함으로써, 전체 면역된 마우스 샘플에서 4개의 총 항원결정기 특이적 CD에 2.43 곱하기 10이 있었습니다. 실제로, 에피토프 특이적 세포 확장이 충분히 견고하다면 농축 과정을 건너뛸 수 있습니다. 농축 절차에 따라 자가 고정 및 투과 단계를 수행하여 사이토카인 및 전사 인자와 같은 세포 내 단백질을 염색할 수 있습니다.

이 방법은 원래 비장과 림프절의 T 세포를 연구하기 위해 고안되었지만 흉선 및 장과 같은 다른 조직에도 적용할 수 있습니다. 이 기술은 또한 인간의 혈액 및 조직 샘플에서 epitype 특정 T 세포를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.