펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

이 절차의 전반적인 목표는 고처리량 384-웰 플레이트 분석법을 사용하여 짧은 펩타이드와 인간 MHC II 면역 단백질의 결합을 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 관심 펩타이드를 사용하여 용액 상 경쟁 결합 분석을 수행함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 평형 상태의 펩타이드-MHC II 복합체를 고결합 ELISA 플레이트에 고정된 anti-MHC II 항체로 캡처합니다.

다음으로, 포획된 복합체를 opium이 표지된 streptavidin과 함께 인큐베이션한 후, 결합하지 않은 streptavidin을 세척하여 제거하고 포획된 opium을 활성화합니다. 최종적으로, 시간 분해 형광 측정법(time resolved fluorometry)을 사용하여 포획된 MHC two 대조 펩타이드의 수준을 정량화할 수 있습니다. 이 방법은 표적 단백질의 면역원성 잠재력에 대한 예비적인 통찰을 제공할 수 있습니다.

이는 in silico 예측 도구의 결과물을 검증하는 데 특히 유용합니다. 384-well 고결합 흰색 ELISA 플레이트의 각 웰에 신선하게 희석한 L 2 43 항체 용액 25 µL를 첨가하여 절차를 시작하십시오. 플레이트를 폴리에스터 필름으로 밀봉하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 그런 다음, 각 테스트 물질의 10 mM 스탁 용액부터 시작하여

펩타이드와 DMSO를 사용하여 3 84-웰 폴리프로필렌 플레이트 3개를 이용해 다음과 같은 희석 시리즈와 시트르산 인산염 완충액을 조제하십시오. 전체 3 84-웰 폴리프로필렌 플레이트 하나를 채우려면 그림과 같이 3개의 별도 EIA 플레이트가 필요함에 유의하십시오. 다음으로, 15 mL 원추형 튜브를 사용하여 선택한 MHC 2 스톡 솔루션을 반응 완충액에서 101 nM 농도로 희석하십시오.

그 다음, 대조 펩타이드를 20 micromolar에서 1:100 비율로 갓 제조한 MHC two 마스터 믹스에 희석하고, 대조 펩타이드가 포함된 MHC two 마스터 믹스 21.5 microliters를 양성 대조군 웰에 첨가합니다. 384-웰 폴리프로필렌 플레이트의 각 테스트 펩타이드 희석액에 대조 펩타이드가 포함된 MHC two 마스터 믹스를 1:1 비율로 첨가하여 이때 결합 반응을 생성합니다. 마지막으로, 폴리에스터 필름으로 결합 반응 용기를 밀봉하고, 흔들림 없이 37 °C의 비 이산화탄소 제어 인큐베이터에서 플레이트를 12~24시간 동안 배양합니다.

다음 날, 3개 84-웰 플레이트의 결합 반응 웰을 중화 버퍼와 1:1 비율로 희석합니다. 그 후, ELISA 플레이트를 웰당 60 µL의 0.05% PBS로 3회 세척합니다. 이어서 3개 84-웰 플레이트의 중화된 결합 반응 용액 25 µL를 항체가 코팅된 3개 84-웰 플레이트에 3회 반복하여 옮깁니다.

ELISA 플레이트의 각 웰에 분주한 후, 폴리에스테르 필름으로 덮어 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 앞서 시연한 것과 같이 ELISA 플레이트를 3회 세척하고, 각 웰에 새로 희석한 streptavidin을 25 µL씩 첨가합니다. 플레이트를 폴리에스테르 필름으로 덮어 상온의 암소에서 1시간 동안 배양합니다.

배양하는 동안, 플레이트당 10 milliliters의 증강 용액을 암소에서 1시간 동안 실온으로 맞춘 후, 시연된 대로 ELIZA 플레이트를 세척하십시오. 그런 다음 각 웰에 25 microliters의 증강 용액을 첨가하고 폴리에스터 필름으로 덮어 암소에서 10분에서 15분 동안 배양합니다. 마지막으로 최적의 설정이 적용된 시간 분해 형광 플레이트 리더기를 사용하여 형광을 측정합니다. 이 대표 실험에서는 MHC 2 대립유전자에 대한 추정 펩타이드 결합물을 분석하기 위해 enterobacter Cloe P 99 beta-lactamase의 성숙 펩타이드 서열을 분석하였습니다.

5% 임계값에서만 MHC II 결합에 필수적인 1번 위치의 P1 앵커 잔기를 가진 DRB1*15:01 결합 펩타이드들이 식별되었습니다. 점수가 2.6 이상인 펩타이드는 결합 가능성이 높습니다. 따라서 5% 임계값에서 상위 11개 펩타이드가 MHC II DRB1*15:01에 결합하는 것으로 예측되었습니다.

본 MHC 클래스 II 결합 분석을 위해 예측된 에피토프의 대표 패널이 선택되었습니다. 15개 잔기로 구성된 베타-락타마제 펩타이드 단편을 화학적으로 합성하여, 추정되는 9량체 MHC 클래스 II 에피토프가 해당 합성 단백질 단편 내에 포함되도록 하였습니다. 이후 방금 시연한 바와 같이, 이러한 합성 펩타이드가 비오틴화된 마이엘린 기본 단백질 B 대조군 펩타이드와 경쟁하여 MHC 클래스 II DRB 1 15 0 1에 결합하는 능력을 분석하였습니다.

합성 펩타이드의 경쟁적 결합 곡선이 여기에 예시되어 있습니다. IC 50 값은 Prism의 단일 부위 경쟁적 결합 비선형 적합 함수를 사용하여 로그 변환된 데이터를 피팅하여 계산하였습니다. 그래프와 표에 나타난 바와 같이, 펩타이드는 개발 후 자연스럽게 세 그룹으로 분류되었습니다: IC 50이 1 µM 미만인 강한 결합제, IC 50이 1 µM 이상 100 µM 미만인 중간 결합제, 그리고 IC 50이 100 µM 이상인 약한 결합제입니다.

이 기술은 분자 면역학 및 바이오 치료제 설계 분야의 연구자들이 인간 환자의 항단백질 면역 반응의 기초가 되는 핵심 분자 인식 사건을 더욱 충분히 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.