펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

이 절차의 전반적인 목표는 고처리량 3 84웰 플레이트 분석을 사용하여 짧은 펩타이드와 인간 MHC 두 면역 단백질의 결합을 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 용액 단계 경쟁 결합 분석을 관심 펩타이드와 함께 수행함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서, 평형 펩타이드 MHC 2 복합체는 고 결합 ELIZA 플레이트에 고정 된 항 MHC 2 항체로 포착됩니다.

다음으로, 포획된 복합체를 스트렙타비딘(streptavidin)이라고 표시된 아편으로 배양한 다음 결합되지 않은 스트렙타비딘을 씻어내고 포획된 아편을 활성화합니다. 궁극적으로, 시간 분해 형광 측정법은 MHC 2 포획 제어 펩타이드의 수준을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 표적 단백질의 면역원성 잠재력에 대한 예비 통찰력을 제공할 수 있습니다.

인실리코(in silico) 예측 변수의 출력을 검증하는 데 특히 유용하며, 3 84의 각 웰에 25마이크로리터의 갓 희석된 L 2 43 항체 용액을 추가하여 절차를 시작합니다. 글쎄요, 고 바인딩 흰색 ELIZA 플레이트는 플레이트를 폴리 에스테르 필름으로 밀봉하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 그런 다음 각 테스트의 10밀리몰 스톡으로 시작합니다.

펩타이드 및 DMSO는 3 84 웰 폴리프로필렌 플레이트를 사용하여 다음과 같은 희석 시리즈와 시트레이트 인산염 인산염 버퍼를 만듭니다. 전체 3 84웰 폴리프로필렌 플레이트에는 그림과 같이 3개의 개별 EIA 플레이트가 필요합니다. 다음으로, 15 밀리리터 원뿔형 튜브를 사용하여 선택한 MHC 두 원액을 반응 완충액에서 101 나노 몰 농도로 희석합니다.

그런 다음 새로 준비된 MHC 2 마스터 믹스에서 대조 펩타이드를 20 마이크로몰에서 1 대 100 비율로 희석하고 대조 펩타이드가 포함된 MHC 2 마스터 믹스 21.5 마이크로리터를 양성 대조군에 첨가합니다. 3 84 웰 폴리 프로필렌 플레이트의 웰, 대조 펩타이드를 포함하는 MHC 2 마스터 믹스를 1 대 1 비율로 각 테스트 펩타이드 희석액에 첨가하여 이때 결합 반응을 생성한다. 마지막으로, 결합 반응을 폴리에스터 필름으로 밀봉하고 흔들림 없이 섭씨 37도의 비이산화탄소 제어 인큐베이터에서 12-24시간 동안 플레이트를 배양합니다.

다음날, 3 84에서 결합 반응 웰을 희석한다. 웰 플레이트는 중화 버퍼와 1:1 비율로 플레이트됩니다. 그런 다음 20 다음 이송 사이에 PBS 0.05% 웰당 60 마이크로리터의 Eliza 플레이트를 3 84 웰 플레이트에서 3 84 웰 플레이트로 3 회 중화하여 25 마이크로 리터의 중화 결합 반응 용액을 3 회 세척합니다.

글쎄, Eliza 플레이트는 배양 후 하룻밤 동안 폴리 에스테르 필름으로 덮인 ELIZA 플레이트를 섭씨 4도에서 배양합니다. 방금 시연한 대로 ELIZA 플레이트를 세 번 세척한 다음 각각 갓 희석한 연쇄상구균 딘 아편 25마이크로리터를 추가합니다. 폴리에스터 필름으로 덮인 플레이트를 실온에서 1시간 동안 어두운 곳에서 잘 배양합니다.

배양 도중, 1 시간 후에 암흑 속에서도 실내 온도에 판 당 10 밀리리터의 향상 용액을 가져 오고, 설명과 같이 ELIZA 플레이트를 세척 한 다음 각 웰에 25 마이크로 리터의 향상 용액을 첨가하고 어둠 속에서 10-15 분 동안 폴리 에스테르 필름으로 덮인 플레이트를 배양합니다. 마지막으로, 아편 설정이 있는 시간 분해 형광판 판독기로 형광을 읽습니다. 이 대표적인 실험에서, 엔테로박터 Cloe P nine nine beta-lactamase의 성숙한 펩타이드 서열을 MHC 2 대립유전자에 대한 추정 펩타이드 결합체에 대해 분석했습니다.

DRB 1, 15, oh, 1, 117 비 또는 펩타이드는 5% 임계값에서만 MHC 2 결합에 필요한 위치 1에서 의무적인 P 1 앵커 잔류물로 확인되었습니다. 점수가 2.6 이상인 펩타이드는 결합제일 가능성이 높습니다. 따라서 5% 임계값에서 상위 11개의 펩타이드만 MHC 2개의 DRB 1, 15, 0, 1과 결합할 것으로 예측됩니다.

이 MHC 2 결합 분석에서 분석을 위해 예측된 에피토프의 대표 패널이 선택되었습니다. 이 15개 잔기의 베타-락타마제 펩타이드 단편을 화학적으로 합성하여 추정되는 노나머 MHC 2개의 에피토프가 합성 단백질 단편 내에 내장되도록 했습니다. 그런 다음 MHC 2 DRB 1 15 0 1에 결합하기 위해 비오틴화된 미엘린 염기성 단백질 B 제어 펩티드와 경쟁하는 이러한 합성 펩티드의 능력을 방금 설명한 바와 같이 분석했습니다.

합성 펩타이드에 대한 경쟁력 있는 결합 곡선이 여기에 설명되어 있습니다. IC 50 값은 프리즘의 단일 사이트 경쟁 결합 비선형 적합 함수를 사용하여 로그 변환 데이터를 피팅하여 계산되었습니다. 그래프에서 볼 수 있듯이 표에서 알 수 있듯이 펩타이드는 자연적으로 3개 그룹으로 나뉘는데, IC 50이 1마이크로몰 이상이지만 100마이크로몰 미만인 IC 50의 중간 정도의 바인더와 IC 50이 100마이크로몰 이상인 약한 바인더의 개발 후.

이 기술은 분자 면역학 및 바이오 치료제 설계 분야의 연구자들이 인간 환자의 항단백질 면역 반응의 기초가 되는 주요 분자 인식 이벤트를 보다 완전히 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.