Name: 펩티드 에피토프의 정량 분석을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-25T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 학습하세요 고처리량 384-웰 플레이트 분석을 사용하여 인간 MHC II 단백질에 대한 단백질 결합을 정량화하는 방법입니다. 이 기술은 면역원성 에피토프 식별과 백신 개발에 필수적인 도구입니다.

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이 작품은 NIH 보조금 R01-GM-098977 및 CBK와 KEG에 R21-AI-098122에 의해 지원되었다. RSS는 공학 이어 학교에서 이어 혁신 프로그램 원정대에 의해 루스 재단 원정대에 의해 부분적으로 부분적으로 지원되었다.

네 개의 주요 활동은 펩티드-MHC II 결합 분석을 포함한다 : 1 바인딩 : 시험 펩티드 용액 상 용해 MHC II 단백질의 결합을 표지 제어 펩티드와 경쟁. 바인딩은 테스트 펩티드 농도의 넓은 범위에 걸쳐 측정된다. 2 - 화면 캡쳐 : 바인딩 반응이 평형에 도달 한 후, 펩타이드 MHC II 단지가 캡처 및 고정 된 항체와 형태에 의존하는 인식하여 결합되지 않은 펩타이드와 단백질에서 분리된다. 3 탐지 : 캡처 제어 펩타이드 정량적 시간 분해 형광을 이용하여 검출한다. 4 - 분석 : 분광 데이터를 처리 플롯 및 테스트 펩타이드와 MHC II 단백질의 농도 의존적​​ 결합 특성을 확인하기 위해 분석된다. 가능한 경우 다음 절차의 여러 단계에서, 액체 처리 로봇의 사용을 권장합니다. 특히 384도 형식으로 자동 분배 및 액체의 희석 더에 사용자 오류, 결과를 최소화일관된 잘 행 웰 볼륨 및 수동 96 - 웰 분석 (데이터 미도시)에 비해 IC 50 값 좁아 95 % 신뢰 구간을 산출한다. 액체 처리 로봇을 사용할 수없는 경우, &quot;(액체 처리 로봇)&quot;주석이 단계를 수동으로 수행 할 수 있습니다. 가능하면 마찬가지로, 384 - 웰 형식과 호환되는 자동화 된 와셔를 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 효과적으로 플레이트 세척 공정을 표준화. 접시 세척기를 사용할 수없는 경우, &quot;(와셔)&quot;주석이 단계를 수동으로 수행 할 수 있습니다. 1. 코트 ELISA 플레이트 (1 일) <ol><li> 10 ㎍ / ㎖의의 작업 농도로 붕산 버퍼에있는 L243 항체 주식 (0.5 ㎎ / ㎖)을 희석. <ol><li> 코트에 하나의 384 - 웰 플레이트, 붕산염 완충액 9.8 ml로 주식 항체의 200 μl를 추가합니다. (대체 스케일링에 대한 보충 스프레드 시트 계산기를 참조하십시오.) </li></ol></li><li> 384 (W)의 각 웰에 L243 항체 용액 25 μl를 추가합니다엘 흰색 ELISA 플레이트 높은 결합. (액체 처리 로봇) </li><li> 폴리 에스테르 필름과 플레이트를 밀봉하고 4 ℃에서 하룻밤 배양 참고 : 각 384 잘 ELISA 판은 15 테스트 한 MHC II 대립 유전자 8 개의 희석에 펩티드뿐만 아니라 긍정적이고 부정적인 컨트롤까지 수용 할 수 있습니다. 이것은 궁극적 중으로 측정치를 산출 할 것이다. </li></ol> 2. 테스트 펩타이드 희석 (1 일)을 확인 <ol><li> DMSO의 각 테스트 펩티드의 10 mM의 스톡부터는 384 - 웰 폴리 프로필렌 플레이트 (표 1)를 사용 구연산염 포스페이트 완충액에서 다음 일련의 희석을 만든다. (액체 처리 로봇) 참고 : 전체 384 웰 폴리 프로필렌 플레이트는 별도의 세 가지 ELISA 플레이트가 필요합니다. 폴리 프로필렌 플레이트의 3 분의 1은 하나의 ELISA 플레이트 (그림 1)이 필요합니다. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody align="center"><tr><td rowspan="2"> 희석 수 </td><td> 볼륨 t오 전 희석 / 재고 걸릴 </td><td> 추가 볼륨 구연산 버퍼 </td><td> 진한. 희석의 </td><td> 진한. 바인딩 반응 </td><td> 진한. 중화 ELISA에 </td></tr><tr><td> (μL) </td><td> (μL) </td><td> (μM) </td><td> (μM) </td><td> (μM) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.7 </td><td> 35.1 </td><td> 195.531 </td><td> 97.765 </td><td> 48.883 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 97.765 </td><td> 48.883 </td><td> 24.441 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 7.1 </td><td> 28.7 </td><td> 19.389 </td><td> 9.695 </td><td> 4.847 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 9.695 </td><td> 4.847 </td><td> 2.424 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 7.1 </td><td> 28.7 </td><td> 1.923 </td><td> 0.961 </td><td> 0.481 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 0.961 </td><td> 0.481 </td><td> 0.24 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 7.1 </td><td> 28.7 </td><td> 0.191 </td><td> 0.095 </td><td> 0.048 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 14.3 </td><td> 14.3 </td><td> 0.095 </td><td> 0.048 </td><td> 0.024 </td></tr><tr><td colspan="6"> 제거하고 희석 수 8 펩타이드 솔루션의 7.1 μl를 폐기합니다. </td></tr></tbody></table> 테스트 펩티드 희석 시리즈의 표 1. 제조. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51308/51308fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51308/51308fig1.jpg" /> 그림 1. 분석을 바인딩 펩타이드의지도를 접시. 폴리 프로필렌 384 - 웰 플레이트에서 펩타이드 희석 (A)지도. 각각의 폴리 프로필렌 판은 노래에 대한 경쟁 결합 반응에 15 펩티드의 세 그룹을 수용 할 수<html> 르 MHC II 대립 유전자. 결합 반응이 평형에 접근 한 후 (B), 각 펩티드 기는 안티 MHC II 항체로 미리 코팅 된 별도의 384 - 웰 ELISA 플레이트에, 중으로 전사된다. 3. MHC II 마스터 믹스 (1 일)를 준비 <ol><li> 반응 완충액 만들기 <ol><li> 구연산 인산 버퍼의 3,920 μL에 1 ㎜ Pefa 공산권의 80 μL 및 옥틸-β-D-glucopyranaside 60 밀리그램을 추가합니다. (대체 스케일링에 대한 보충 스프레드 시트 계산기를 참조하십시오.) </li></ol></li><li> 15 ML 원뿔 튜브 (표 2)를 사용하여 반응 버퍼에서 101 nm의 선택 MHC II의 주식 솔루션을 희석. 참고 : MHC II 농도는 궁극적으로 중화 ELISA 분석에서 결합 반응, 25 nm의 50 nm의 수 있습니다. MHC II의 주식 농도는 제조 로트 번호에 따라 달라집니다. (보충 스프레드 시트 계산기를 참조하십시오.) </li></ol>&quot;&gt; <tbody><tr><td> MHC II 대립 유전자 DRB1 *이 : </td><td> 1501 </td></tr><tr><td> MHC II 스톡 농도 (㎎ / ㎖) </td><td> 1.3 </td></tr><tr><td> MHC II 스톡 농도 (MM) </td><td> (20) </td></tr><tr><td> 권. MHC II 재고 추가하는 (ML) </td><td> 14.65 </td></tr><tr><td> 권. 반응 버퍼에 추가하는 (ML) : </td><td> 2885.35 </td></tr><tr><td> MHC II 마스터 믹스 농도 (NM) </td><td> 101 </td></tr></tbody></table> MHC II의 마스터 믹스의 표 2. 준비. 4. 부정과 긍정적 인 컨트롤 (1 일)를 준비 <ol><li> 2.1 단계에서 384 웰 폴리 프로필렌 플레이트 (그림 1A)의 &quot;대조군&quot;잘에 구연산 인산 버퍼의 21.5 μl를 추가합니다. </li><li> 384 - 웰 폴리 프로필렌 플레이트의 &quot;긍정적 인 제어&quot;잘에 구연산 인산 버퍼의 21.5 μl를 추가합니다. 참고 : &quot;포지를TIVE 컨트롤 &quot;아래 섹션 5에 완료됩니다. </li><li> 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 단계 3.2 피펫에서 MHC II 마스터 믹스의 49.5 μl를 제거합니다. </li><li> 4.3 단계에서 MHC II 마스터 믹스의 49.5 μL에 구연산 버퍼의 0.5 μl를 추가합니다. </li><li> 384 - 웰 폴리 프로필렌 플레이트의 &quot;대조군&quot;잘 (그림 1A)에 단계 4.4에서 MHC II 마스터 믹스를 조정 농도의 21.5 μl를 추가합니다. 참고 :이 샘플은 MHC II 단백질, NO 제어 펩티드, 및 NO 테스트 펩타이드를 포함하는 제로 신호 음의 컨트롤을 나타냅니다. </li></ol> 5. MHC II 마스터 믹스에 적절한 제어 펩타이드 (1 일)를 추가 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> MHC II 대립 유전자 DRB1 * </td><td> 바이오틴 제어 펩타이드 </td><td> (잔류) </td><td> 순서 </td></tr><tr><td> 0101 </td><td> 독감 HA-B </td><td> (306-318) </td><td> 비오틴 (AHX) (AHX) PRYVKQNTLKLAT - 아미드 </td></tr><tr><td> 0301 </td><td> 미오글로빈 </td><td> (137-148) </td><td> 비오틴 (AHX) - (AHX) LFRKDIAAKYKE-OH </td></tr><tr><td> 0401 </td><td> YAR-B </td><td> (1-14) </td><td> 비오틴 (AHX) (AHX) YARFQSQTTLKQKT-OH </td></tr><tr><td> 0701 </td><td> TetTox-B </td><td> (830-843) </td><td> 비오틴 (AHX) (AHX) QYIKANSKFIGITE-OH </td></tr><tr><td> 1101 </td><td> 독감 HA-B </td><td> (306-318) </td><td> 비오틴 (AHX) (AHX) PRYVKQNTLKLAT - 아미드 </td></tr><tr><td> 1501 </td><td> MBP-B </td><td> (84-102) </td><td> 비오틴 (AHX) (AHX) NPVVHFFKNIVTPRTPPPS-OH </td></tr></tbody></table> * 우리는 경제를 위해 10 ㎎의 규모를 주문하는 것이 좋습니다. 표 3. 다양한 MHC II 대립 유전자에 대한 컨트롤 펩티드. * <ol><li> 20 μM에 희석 주식을 산출하는 신선한 DMSO에 (DMSO 400 μM에 저장) 제어 펩타이드 1:20 희석. <ol><li> 25 ㎕를 400 μM 제어 펩타이드에 추가475 μL의 DMSO. 주 :이 과량이지만 점성 DMSO 용액의 정확한 핸들링을 허용한다. </li></ol></li><li> 또한 단계 3.2에서 MHC II 마스터 믹스로 단계 5.1 (20 ㎜) 1:100에서 제어 펩타이드를 희석. <ol><li> MHC II 마스터 믹스의 나머지 2,850.5 μL에 단계 5.2에 희석 제어 펩타이드의 28.8 μl를 추가합니다. </li></ol></li><li> 384 - 웰 폴리 프로필렌 플레이트 (4.2 단계) (그림 1A)의 양의 조절도에 제어 펩타이드 (단계 5.2)와 MHC II 마스터 믹스의 21.5 μl를 추가합니다. 주 :이 표본은 MHC II 단백질, 조절 펩티드, 및 NO 테스트 펩티드를 함유하는 높은 신호 양성 대조군을 나타낸다. </li></ol> 6. 바인딩 반응 (1 일)을 확인 <ol><li> 바인딩 반응을 생성하기 위해 1:1 비율로 시험 펩타이드 희석 (2.1 단계)에 각각 제어 펩타이드 (단계 5.2)를 포함하는 MHC II 마스터 믹스를 추가합니다. <ol><li> 콘을 포함하는 MHC II 마스터 믹스의 21.5 μl를 추가2.1 단계에서 각각의 테스트 펩타이드 희석의 21.5 μL로 단계 5.2에서 TROL 펩타이드. (액체 처리 로봇) </li></ol></li><li> 폴리 에스테르 필름과 바인딩 반응을 밀봉하고 흔들림없이 37 ° C에서 비-CO 2 제어 배양기에서 12 ~ 24 시간을 배양한다. </li></ol> 7. 중화 바인딩 반응 (2 일)을 전송 <ol><li> 37 ° C 배양기에서 바인딩 반응 (단계 6.2)를 포함 384 - 웰 폴리 프로필렌 플레이트를 제거합니다. </li><li> 중화 버퍼와 바인딩 반응 1:1 희석. (액체 처리 로봇) <ol><li> 물론 각 바인딩 반응에 중화 버퍼의 43 μl를 추가합니다. </li></ol></li><li> 4 ° C에서 ELISA 플레이트 (단계 1.3)를 제거하고 PBS-0.05 % 트윈 20 60 ㎖ / 잘으로 배를 세척한다. (와셔) </li><li> 이전 단계 7.3에서 항체 코팅 된 384 웰 ELISA 플레이트의 세중의 우물에 단계 7.2에서 각 중화 바인딩 반응 25 μL. (그림 1 </강한&gt;) (액체 처리 로봇) </li><li> 밤새 2.5 시간 동안 37 ° C의 배양기 또는 4 ° C 냉장고에있는 폴리 에스테르 필름 및 장소 ELISA 플레이트를 커버. </li></ol> 8. ELISA 개발 (2 일 또는 3) <ol><li> 단계 7.5에서 ELISA 플레이트를 제거, 60 μL / 잘 PBS-0.05 % 트윈로 3 회 세척한다. (와셔) </li><li> DELFIA 분석 버퍼에 스트렙 타비 딘 - 유로퓸 원액 (0.1 ㎎ / ㎖ 스트렙 타비 딘, 7 Eu를 3 + / 스트렙 타비 딘) 1,000 배 희석. <ol><li> 하나의 384 - 웰 플레이트를 들어, 10 ㎖ 분석 버퍼에 10 ㎕의 스트렙 타비 딘 - 유로퓸을 희석. </li></ol></li><li> 단계 8.1에서 384도 ELISA 플레이트의 각 웰에 희석 스트렙 타비 딘 - 유로퓸의 25 μl를 추가합니다. (액체 처리 로봇) </li><li> 실온에서 1 시간 동안 어둠 속에서, 폴리 에스테르 필름 및 장소 플레이트 커버. 참고 : 1 시간 배양 동안 냉장고에서 향상 솔루션을 제거하고 RO의 어둠 속에서 10 ㎖ / 판 따로톰 온도. </li><li> 1 시간 배양 한 후, 60 μL / 잘 PBS-0.05 % 트윈으로 단계 8.3 배에서 384도 ELISA 플레이트를 세척한다. (와셔) </li><li> 단계 8.5에서 384도 ELISA 플레이트의 각 웰에 향상 솔루션의 25 μl를 추가합니다. (액체 처리 로봇) </li><li> 폴리 에스테르 필름 : 384 - 웰 ELISA 플레이트를 커버 플레이트는 15 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 앉을 수있다. </li><li> (200), 정지이자 :. 1,000 예 (340), 엠 15 분 배양 한 다음, 한 번 예를 들어, 유로퓸 설정으로 해결 형광 플레이트 리더 (시작이자를 사용하여 단계 8.7에서 384도 ELISA 플레이트의 형광을 읽고 . 615, 차단 : 없음, PMT : 자동 / 잘 읽습니다 : 50). </li></ol> 9. 데이터 분석 <ol><li> 나란히 열에서 3 복제 값 (, Y = 형광 측정 X = 테스트 펩타이드 농도)와 XY 형식의 그래프에 데이터를 입력합니다. </li><li> 모든 데이터의 X 값을 변환 로그 : X = 로그 (X) </li><li> 로그 TRA를 장착IC 50 값을 추출 할 수있는 하나의 현장 경쟁력있는 결합 모델과 데이터를 nsformed. </li><li> 음성 대조군의 평균 값에 하한값을 제한. </li><li> 세계적으로 최고 값에 맞게 글로벌 맞는 매개 변수 아래 또는 양성 대조군 같다는 것을 확실히한다. </li></ol>

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</ol>

레너드 모이는에 의해 고용 및 EpiVax, 주식, 프로비던스,로드 아일랜드에있는 개인 소유의 생명 공학 회사의 스톡 옵션을 보유하고 있습니다. 이 연구 보고서에 포함 된 작품은 회사의 상업적인 목표와 연관 될 수있는 편견이다.

Biotherapeutics에 2012 년 32에서 상위 5 개 판매 약의 네를 대표하는 현대 의학의 초석로 자신을 설립했다. 바이오 의약 부문은 몇 년 6 지속 성장을 보여 왔으며, 새로운 에이전트의 지속적인 발전뿐만 아니라 바이오시 밀러의 등장은 바이오 의약품 파이프 라인을 확장했다. , 미래를 찾고 평가하고 단백질 치료제의 면역 원성을 완화하는 것은 초기 단계의 biotherapeutic 개발의 중요한 부분이 될 것입니다. 이 과정을 용이하게하기 위해, 생물 공학자는 에피토프 예측 16-22에 대한 계산 방법 중 자신뿐만 아니라 기능 3,23-26을 유지하면서 면역 원성을 줄이기 위해 노력 통합 단백질 설계 알고리즘을 도와 줄 수 있습니다. 마찬가지로, 백신 설계와 개발은 예측 알고리즘 4의 전원을 활용할 수 있으며, 역 신학의 지속적인 성숙을 보호 얻을 것으로 예상된다이전의 노력 33 회피 한 감염원의 ...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/51308/a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis">A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes</a>.&#160; There were typos in the Protocol section and Table 2.
Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:
Add 80 &#181;l of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-&#946;-D-glucopyranaside to 3,920 &#181;l of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
to:
Add 80 &#181;l of 1 mM Pefa Bloc and 60 &#181;g of octyl-&#946;-D-glucopyranaside to 3,920 &#181;l of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
Step 5.2&#160;in the Protocol was updated from:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
to:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 &#181;M) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
Table 2 was updated from:
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="376">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC II Allele DRB1*:</td>
			<td>1501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mg/ml)</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mM)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. MHC II Stock to Add (ml)</td>
			<td>14.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. Reaction Buffer to Add (ml):</td>
			<td>2885.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Master Mix Concentration (nM)</td>
			<td>101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="376">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC II Allele DRB1*:</td>
			<td>1501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mg/ml)</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (&#956;M)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. MHC II Stock to Add (&#956;l)</td>
			<td>14.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. Reaction Buffer to Add (&#956;l):</td>
			<td>2885.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Master Mix Concentration (nM)</td>
			<td>101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/51308/a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis">A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes</a>.&#160; There were typos in the Protocol section and Table 2.

Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

단백질 치료제 6의 가장 빠르게 성장하고있는 클래스이며, biotherapeutic 파이프 라인의 급속한 확장은 단백질 의약품의 개발 및 사용과 관련된 문제에 대한 증가하는 관심을 집중하고있다. 하나의 고유 한 고려 사항은 건강 기능 면역 시스템의 모든 세포 단백질이 항원 제시 세포 (APC를)에 의해 샘플링되고 있다는 사실에서 유래한다. 일단 장갑차에 의해 내면화, 단백질은 작은 펩타이드 조각으로 절단하고, 추정 면역 원성 세그먼트 클래스 II 주요 조직 적합성 복합체 단백질 (MHC II)의 홈에로드됩니다. 펩티드-MHC II 복합체 후 APC 표면 상에 표시하고, 진정한 면역 원성 펩티드는, 동족 CD4 T 세포 표면 수용체 7과의 삼원 MHC II-펩티드-T 세포 수용체 복합체를 형성하고, T 세포 에피토프를 지칭한다. 이 중요한 분자 인식 이벤트는 T 세포 활성화에 결과 복잡한 신호 폭포, 사이토 카인의 방출을 시작합니다의, CD4 T 세포 매개 성 B 세포의 성숙, 그리고 바인딩과 잘못된 외래 단백질을 취소의 IgG 항체를 순환 궁극적으로 생산. 따라서, 면역 원성 단백질을 구성하는 T 세포의 항원을 확인하고 MHC II 복합체 형성에 대한 책임이 키 잔류 돌연변이에 의해 deimmunized 될 수 있습니다. 이는 T 세포 에피토프가 많고 광범위 면역 원성 단백질에 걸쳐 분산 될 수 있다는 것은 주목 부담 및 에피토프 삭제 돌연변이의 대부분은 단백질 기능 또는 안정성의 부주의 손실이 발생할 가능성이있다. 따라서 엔지니어링 biotherapies가 복잡하고 기술적으로 도전적인 목표 일 수있다 deimmunized하지만, 성공적인 T 세포 에피토프 삭제 프로젝트 3,5,8-12의 몇 가지 예는 존재한다. 큰폭 항체 치료제에 한정되는 그라프 기반 &quot;인간화&quot;달리 에피토프 삭제 불문 서열, 구조, 기능을 본질적으로 임의의 단백질 표적에 적용될 수 있고, 또는 homologo의 가용성우리 인간의 골격. 이러한 접근 방식을 구현하는 첫 번째 단계는 표적 단백질 서열 내에 삽입 키 펩티드 에피토프의 확인이다. 합성 펩티드 및 재조합 인간 MHC II 분자를 사용하여 높은 처리량 생화학 적 분석은 에피토프 식별 및 완화 1,3-5에 빠른 예비 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 ELISA 유형 분석은 다른 단백질 / 백신 설계와 개발 도구의 강력한 보완 할 수 있습니다. 예를 들어, 에피토프 매핑 한 잘 설립 된 실험 방법은 시간, 노동에 의존하고 집중적 인 생체 세포 증식 시험 법 (15) 자원. 요약하면, 표적 단백질의 기본 시퀀스가​​ 제 겹치는 펩타이드의 패널로 분할되고, 12 잔기 종종 15 머는 인접한 펩티드에 대한 중복. 펩티드 패널은 화학적으로 합성되는 각 펩티드의 면역 원성은 주연 bloo 사용해 여러 면역 분석법 중 하나에서 시험된다인간 공여자로부터 단리 13,14 D 단핵 세포 (PBMC). 결과에 더 큰 신뢰를 제공하기 위해, 펩티드는 일반적으로 50 개 이상의 다른 기증자로부터 PBMC와 복제에 시험한다. deimmunization 궁극적 인 목표입니다 경우, 작업은 변이 된 펩티드의 추가 패널을 생산하고 이후의 기능 분석 (10)의 전체 길이의 단백질로 어떤 deimmunizing 돌연변이를 도입하기 전에 PBMC의 분석에 새로운 펩타이드 패널을 테스트하기 위해 필요에 의해 더욱 악화된다. 이러한 세포의 분석은 인간의 환자에서 면역 원성 가능성을 평가하기위한 황금 표준 남아 있지만, 이러한 철저한 접근 방식의 효율성은 신속하고 높은 처리량 MHC II-펩타이드 결합 분석을 이용하여 추정 면역 원성 항원을 사전 필터링에 의해 개선 될 수 있습니다. 마찬가지로, 생화학 펩티드-MHC II 결합 분석은 라디칼 에피토프 식별 프로세스를 가속화하기 위해 실리 방법의 예측과 조합 될 수있다.T 세포 에피토프 예측을위한 전산 다양한 도구가 존재, 예 ProPred (16)를 포함, MHCPred 17 SVRMHC 18, ARB 19, 20 SMM-정렬, NetMHCIIpan 21뿐만 아니라 EpiVax (22)에 의해 같은 EpiMatrix 같은 독점 도구를 제공합니다. 마찬가지로, 에피토프의 예측은 최근에 다른 생물 정보학 및 deimmunizing 돌연변이가 단백질의 구조와 기능 23-26를 중단시킬 위험을 완화하도록 설계된 통합 단백질 deimmunization 알고리즘을 생성하는 분자 모델링 도구와 결합되었습니다. 여러 가지 에피토프 예측이 합리적으로 정확한 27,28 것으로 입증되었지만, 계산 결과는 변함없이 실험적인 검증을 필요로한다. 빠른, 높은 처리량 및 비용 효과적인 실험 방법은 실리 에피토프 예측에 대한 예비 필터로 가장 적합합니다. 비슷한 맥락에서, 에피토프 예측 역 vaccinolo에 대한 항원의 선택을 구동 할 수있다GY (29, 30). 예를 들어, 생물 정보학의 발전은 빠르게 병원체 프로테옴에서 추출한 전체 단백질이나 펩티드 에피토프의 형태로 백신 후보를 식별하는 전체 게놈 화면을 수득했다. 이 가능하게 기술 보호 백신의 발견과 개발을 재편하는 동안, 그것은 면역 백신 후보의 intractably 큰 목록의 형태로 새로운 도전을 소개합니다. 높은 처리량 펩티드-MHC II 결합 분석은 펩타이드 결합 친화도를 정량화하고 여러 MHC II 대립 유전자 사이에 성행위를 결합하여 항원의 선택을 안내 할 수 있습니다. 단백질 deimmunization와 마찬가지로, 이러한 실험 방법은 궁극적으로 유망한 백신 리드의 계산 예측을 검증해야합니다. 여기에, 384도 형식으로 축소 펩타이드 MHC II 결합 분석을 설명한다. 이 프로토콜은 고도로 병렬화 이전에 96 - 웰 플레이트 형식 1,3-5 설명에 비해 최대 75 %에 의해 시약 비용을 절감 할 수 있습니다. 단일 LIQUI 사용D 로봇을 처리,이 방법은 하나의 연구자가 쉽게 미만 48 시간에서 여덟 농도와 네 MHC II 대립 유전자 유형의 범위 세중 약 구십 테스트 펩티드를 분석 할 수 있습니다. 이 문서는 하나의 MHC II 대립 유전자에 대한 일곱 실험 펩타이드의 분석을위한 하나의 384 - 웰 ELISA 플레이트의 설치를 설명하지만 쉽게 원하는 펩타이드 및 / 또는 MHC의 숫자로 실험을 확장 할 수 있도록 확산 시트 계산기는 보충 자료로 제공됩니다 II 분자.

<table><tbody><tr><td>소듐 테트라보레이트 데카하이드레이트</td><td>시그마</td><td>221732</td><td></td></tr><tr><td>시트르산</td><td>시그마</td><td>C1901</td><td></td></tr><tr><td>이염기성 소듐 포스페이</td>트 <td>시그마</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>트리즈마 HCl</td><td>옴니푸르</td><td>9310</td><td></td></tr><tr><td>트윈-20</td><td>시그마</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>100% DMSO</td><td>시그마</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>옥틸-& 베타, -D-Glucopyranaside</td><td>Fischer</td><td>29836-26-8</td><td></td></tr><tr><td>Pefa 블록 SCF</td><td>Roche</td><td>1158591600</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 10x 인산염 완충 식염수</td><td>Invitrogen</td><td>14200-166</td><td></td></tr><tr><td>DELFIA 분석 완충액</td><td>Perkin Elmer</td><td>4002-0010</td><td></td></tr><tr><td>DELFIA 강화 완충액</td><td>Perkin Elmer</td><td>4001-0010</td><td></td></tr><tr><td>Europium Labelled Streptavidin</td><td>Perkin Elmer</td><td>1244-360</td><td></td></tr><tr><td>L243 anti-HLA-DR 항체</td><td>Biolegend</td><td>307602</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated 추적 펩타이드</td><td>21세기 생화학</td><td>맞춤 주문</td><td></td></tr><tr><td>테스트 펩타이드(1-4mg, 순도 85%)</td><td>Genscript</td><td>맞춤 주문</td><td></td></tr><tr><td>정제 HLA-DRB1 단량체(비오틴화)</td><td>Benaroya Research Institute*</td><td>맞춤 주문</td><td></td></tr><tr><td>384웰 백색 EIA/RIA 플레이트</td><td>Thermo</td><td>460372</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 384웰 플레이트</td><td>Costar</td><td>3656</td><td></td></tr><tr><td>필름, AxySeal, 80 & 마이크로; m, ELISA 어플리케이터&nbsp;</td><td>Axygen Ascientific</td><td>PCR-SP</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ Water</td><td>해당 없음</td><td>해당 없음 Epimotion</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Handler (또는 유사)</td><td>Eppendorf</td><td>5075</td><td></td></tr><tr><td>Select TS Plate Washer (또는 유사)</td><td>BioTek</td><td>405</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Gemini Microplate Reader (또는 유사)</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*재조합 인간 MHC II 분자는 Benaroya Tetramer Core Laboratory에서 얻을 수 있습니다.&nbsp; 참조: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory</td></tr></tbody></table>

펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 mhc ii 결합 분석

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

재조합 인간 MHC II 분자와 생화학 적 분석은 신속하고 정량적 인 면역 원성 항원 인식에 대한 통찰력, 삭제, 또는 디자인 1,2를 제공 할 수 있습니다. 여기, 펩타이드 MHC II 결합 분석은 384도 형식으로 조정됩니다. 축소 프로토콜 75 %의 시약 비용을 절감하고 이전에 96 - 웰 프로토콜 1,3-5 기술보다 더 높은 처리량입니다. 특히, 실험 설계는 384도 ELISA 플레이트 당 하나의 MHC II 대립 유전자에 대해 최대 15 펩티드의 강력하고 재현성있는 분석을 허용합니다. 하나의 액체 처리 로봇을 사용하여,이 방법은 하나의 연구자 미만 48 시간에서 여덟 농도와 네 MHC II 대립 유전자 유형의 범위 세중 약 구십 테스트 펩티드를 분석 할 수 있습니다. 단백질 deimmunization 또는 백신의 설계 및 개발 분야에서 일하는 다른 프로토콜이 자신의 작업을 촉진하는데 유용하게 찾을 수 있습니다. 특히, 단계별 지침과 시각적 형식주피터의 다른 사용자가 빠르고 쉽게 자신의 실험실에서이 방법을 확립 할 수 있도록해야한다.

엔테로 박터 클로 아카 P99 베타 - 락타 마제 (BLA) (Genbank에 ID 번호의 X07274.1)의 성숙 펩타이드 서열은 MHC II 대립 유전자 DRB1 * 1501 (표 4)으로 추정 펩타이드 바인더 ProPred (16)를 분석 하였다. ProPred은 필수 P1 앵커 잔류 물 117 nonamer 펩티드를 확인 (즉, M, L, I, V, F, Y, 31 바인딩 MHC II에 필요한 위치 1에서 W). 5 %의 임계 값으로 만보다 큰 득점 2.6 같은지 가능성 바인더와 펩티드이다. 따라서, 5 %의 문턱에서, 상위 11 펩티드 * 1501 MHC II의 DRB1을 결합 할 것으로 예상된다. <img alt="표 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_uplo...

재조합 인간 MHC II 분자와 생화학 적 분석은 신속하고 정량적 인 면역 원성 항원 인식에 대한 통찰력, 삭제, 디자인을 제공 할 수 있습니다. 여기에, 384 - 웰 플레이트를 확장 펩타이드 MHC II 결합 분석을 설명한다. 이 비용 효과적인 포맷은 단백질 deimmunization 백신 디자인 및 개발의 분야에서 유용한다.

펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

이 절차의 전반적인 목표는 고처리량 384-웰 플레이트 분석법을 사용하여 짧은 펩타이드와 인간 MHC II 면역 단백질의 결합을 정량화하는 것입니다. 이는 먼저 관심 펩타이드를 사용하여 용액 상 경쟁 결합 분석을 수행함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 평형 상태의 펩타이드-MHC II 복합체를 고결합 ELISA 플레이트에 고정된 anti-MHC II 항체로 캡처합니다.다음으로, 포획된 복합체를 opium이 표지된 streptavidin과 함께 인큐베이션한 후, 결합하지 않은 streptavidin을 세척하여 제거하고 포획된 opium을 활성화합니다. 최종적으로, 시간 분해 형광 측정법(time resolved fluorometry)을 사용하여 포획된 MHC two 대조 펩타이드의 수준을 정량화할 수 있습니다. 이 방법은 표적 단백질의 면역원성 잠재력에 대한 예비적인 통찰을 제공할 수 있습니다.이는 in silico 예측 도구의 결과물을 검증하는 데 특히 유용합니다. 384-well 고결합 흰색 ELISA 플레이트의 각 웰에 신선하게 희석한 L 2 43 항체 용액 25 µL를 첨가하여 절차를 시작하십시오. 플레이트를 폴리에스터 필름으로 밀봉하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 그런 다음, 각 테스트 물질의 10 mM 스탁 용액부터 시작하여펩타이드와 DMSO를 사용하여 3 84-웰 폴리프로필렌 플레이트 3개를 이용해 다음과 같은 희석 시리즈와 시트르산 인산염 완충액을 조제하십시오. 전체 3 84-웰 폴리프로필렌 플레이트 하나를 채우려면 그림과 같이 3개의 별도 EIA 플레이트가 필요함에 유의하십시오. 다음으로, 15 mL 원추형 튜브를 사용하여 선택한 MHC 2 스톡 솔루션을 반응 완충액에서 101 nM 농도로 희석하십시오.그 다음, 대조 펩타이드를 20 micromolar에서 1:100 비율로 갓 제조한 MHC two 마스터 믹스에 희석하고, 대조 펩타이드가 포함된 MHC two 마스터 믹스 21.5 microliters를 양성 대조군 웰에 첨가합니다. 384-웰 폴리프로필렌 플레이트의 각 테스트 펩타이드 희석액에 대조 펩타이드가 포함된 MHC two 마스터 믹스를 1:1 비율로 첨가하여 이때 결합 반응을 생성합니다. 마지막으로, 폴리에스터 필름으로 결합 반응 용기를 밀봉하고, 흔들림 없이 37 °C의 비 이산화탄소 제어 인큐베이터에서 플레이트를 12~24시간 동안 배양합니다.다음 날, 3개 84-웰

a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

에피토프 특정 T 세포의 낮은 주파수 인구를 분리하고 유동 세포 계측법을 기준으로 결과를 분석 MHC tetramers 및 자기 microbeads :이 프로토콜은 펩타이드의 사용을 설명합니다. 이 방법은에서 관심 내생 T 세포 인구의 직접적인 연구를...

펩타이드 : 에피토프 특정 T 세포의 MHC Tetramer 기반 강화

이 비디오는 펩타이드 마이크로어레이 기술을 적용하여 히스톤 펩타이드에 대한 PTM(Post-Translational Modification)을 인식하는 항체의 특이성을 프로파일링하는 기술을 보여줍니다. 알려진 PTM 조합과 함께 고정된 형광단 접합 히스톤 펩타이드를 포함하는 마이크로어레이 슬라이드를 표적 PTM 특이적 항체로 처리합니다. 이 프로세스는 표적에 대한 항체의 특이성과 비표적 PTM과의 잠재적인 교차 반응을 식별하는 데 도움이 됩니다.

항체의 특이성 프로파일링을 위한 펩타이드 마이크로어레이 기술

이 원고는 기능화된 평면 지지 지질 이중층과 접촉하는 T 세포의 면역학적 시냅스 내에서 발생하는 T 세포 항원 수용체(TCR)와 항원 펩타이드 적재 MHC 분자 사이의 결합 역학을 측정하기 위해 (단일 분자) Förster Resonance Energy Transfer(FRET) 기반 분석을 수행하는 방법을 설명합니다.

TCR-pMHC 바인딩 측정<em&gt; 현장에서</em&gt; FRET 기반의 현미경 분석을 사용하여

여기에서는 인간 백혈구 항원에 의해 제시되는 T-세포 수용체와 종양 항원 사이의 상호 작용의 본질이 T-세포 기능을 어떻게 지배하는지 결정하기 위해 실험실에서 일반적으로 사용하는 방법을 설명합니다. 이러한 방법에는 단백질 생산, X선 결정학, 생물 물리학 및 기능적 T 세포 실험이 포함됩니다.

X 선 결정학, 생물 물리학 및 기능 분석 실험을 사용하면 메커니즘 집행 T 세포 암 항원의 수용체 인식을 확인하는 방법

여기, 우리 뒤에 고해상도 (~ 30000) MS-탐지 아군된 펩타이드 표준 단일 클론 항 체에의 정량화에 대 한 펩 티 드 파편의 펩 티 드 선구자 이온 이동성 분리와 결합 하 여 크로마 분석 결과 설명 다이제스트입니다.

액체 크로마토그래피 이온 이동성 QTOF 질량 분석에 의해 단백질 바이오에 주인 세포 단백질의 정량화에 대 한 HS MRM 분석 결과

여기에서 저자는 도트-블롯 하이브리드화를 통해 정제된 단클론 항체와 펩타이드 스캐닝을 사용하여 선형 항원 항원결정기를 정의하는 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시합니다. 그런 다음 식별된 항원결정기를 치료 및 진단 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

펩타이드 모노클로 날 항체 인식 선형 B 세포 에피토프의 확인을 스캔 보조

Biopanning 세균 디스플레이 라이브러리는 항 체에 대 한 강력한 대안 펩 티 드 선호도 시 약의 발견에 대 한 검증 된 기술입니다. 여기에 반자동된 정렬 방법 biopanning 잘못 된 반응의 발생을 감소 간소화 했다. 여기 우리가 생각 과정 및 후보자를 평가 하 고 최소화 다운스트림 분석에 적용 되는 기술을 설명 합니다.

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

Qa-1 (인간에서 HLA-E) 비 고전 중요 한 조직 적합성 복잡 한 1b 분자의 그룹에 속한다. Qa-1-바인딩 epitopes와 면역 조직 특정 면역 규칙을 증강 하 고 여러 자가 면역 질환 개선에 표시 되었습니다. 여기는 Qa-1 단백질에 epitopes의 식별에 겹치는 펩타이드 라이브러리 전략에 설명합니다.

Qa-1 단백질에 Epitopes를 매핑할 겹치는 펩타이드 라이브러리

여기, 전 대 한 프로토콜 선물이 vivo 항 원 특정 CD8의 질적 검색+ T 세포. 분석은 단일 셀 정지 적은 양의 혈액 또는 기관에서 가능 합니다. 광범위 한 연구는 세포 독성 T 세포 응답 (예방 접종과 암 immunotherapy 연구)의 분석을 필요로 합니다.

반대로 벡터 및 안티 transgene 특정 CD8의 동시 정량화+ T 세포가 MHC를 통해 내가 Tetramer 바이러스 성 벡터와 예방 접종 후 얼룩

B형 간염 바이러스(HBV)유래 펩타이드 매트릭스에 기초하여, HBV 특이적 CD4 T 세포 반응은 HBV 특이적 CD4 T 세포 에피토프의 식별과 병행하여 평가될 수 있었다.

펩타이드 매트릭스에 근거한 HLA-DR-제한 CD4 T 세포 에피토프의 HBV 특정 CD4 T 세포 반응 및 식별의 분석

여기서, 우리는 고품질 면역 펩티도믹스 데이터를 제공하는 마우스 및 인간 세포주로부터 MHC 급 I 및 클래스 II 펩티드 복합체의 정화를 위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 시판되는 항체를 사용하여 샘플 준비에 중점을 둡니다.

면역 펩티도믹스: 질량 분광분석 분석을 위한 마우스 및 인간 MHC 급 I-및 II 관련 펩타이드의 격리

학습하세요 고처리량 384-웰 플레이트 분석을 사용하여 인간 MHC II 단백질에 대한 단백질 결합을 정량화하는 방법입니다. 이 기술은 면역원성 에피토프 식별과 백신 개발에 필수적인 도구입니다.

펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

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