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Introduzione alla microscopia ottica

Overview

Il microscopio ottico è uno strumento utilizzato dai ricercatori in molti campi diversi per ingrandire i campioni fino a mille volte le loro dimensioni originali. Nella sua forma più semplice, è composto da una lente trasparente che ingrandisce il campione e una fonte di luce per illuminarlo. Tuttavia, la maggior parte dei microscopi ottiche sono molto più complessi e ospitano numerose lenti sintonizzate con dimensioni strettamente controllate, tutte all'interno del corpo del microscopio stesso e in componenti come gli obiettivi e gli oculari. In questo video, i componenti principali del microscopio ottico sono descritti e i loro usi e funzioni sono spiegati in dettaglio. Vengono inoltre introdotti i principi di base di ingrandimento, messa a fuoco e risoluzione. Il funzionamento di base del microscopio ottico inizia con il portare la luce al campione e garantire che la sorgente luminosa sia della corretta intensità, direzionalità e forma al fine di produrre l'immagine della migliore qualità. Successivamente, il campione deve essere ingrandito correttamente e messo a fuoco per visualizzare la regione di interesse. Esistono molte applicazioni pratiche per la microscopia ottica, tra cui la visualizzazione di cellule e tessuti macchiati o non macchiati, la risoluzione di piccoli dettagli di campioni e persino l'ingrandimento di una regione di interesse durante l'intervento chirurgico per assistere con procedure complesse su scala micron.

Procedure

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Il microscopio ottico è uno strumento utilizzato per ingrandire i campioni di ricerca. I microscopi ottici sono uno strumento analitico inestimabile che ha il potenziale per consentire ai ricercatori scientifici di visualizzare oggetti a 1000 volte le loro dimensioni originali. Come vedrai, il microscopio ottico funziona secondo alcuni principi di base, ma ha applicazioni quasi illimitate per la visualizzazione di campioni in laboratorio.

Come suggerisce il nome, il microscopio ottico richiede una sorgente luminosa, che produce luce che può essere focalizzata, da una lente a condensatore, sul campione.

La luce che illumina il campione raggiunge una lente nota come lente dell'obiettivo, che crea un'immagine ingrandita che viene invertita o capovolta. L'oculare, o lente oculare, ingrandisce ulteriormente l'immagine, che l'occhio riceve. Ulteriori elementi ottici possono essere introdotti nel percorso della luce per correggere l'immagine, in modo che l'occhio la veda nell'orientamento corretto. I microscopi che utilizzano più lenti come quella che vedete qui sono indicati come microscopi composti.

In un microscopio composto, l'ingrandimento totale viene calcolato moltiplicando l'ingrandimento della lente dell'obiettivo per l'ingrandimento della lente oculare o oculare. Con una lente obiettivo 40X e una lente oculare 10X, l'ingrandimento totale è 400X.

Per aiutare a stimare le dimensioni degli oggetti al microscopio, è possibile utilizzare un reticolo oculare, una scala proiettata sull'immagine. A ingrandimento più elevato, i segni di spunta nel reticolo dell'oculare rappresenteranno distanze più piccole rispetto a quando vengono visualizzati a ingrandimenti inferiori.

Oltre all'ingrandimento, un altro aspetto dell'ottica del microscopio è la risoluzione. La risoluzione si riferisce alla più breve distanza risolvibile tra due oggetti nell'ambito. Man mano che le teste di questi personaggi diventano sempre più chiare e la risoluzione aumenta, la distanza osservabile più breve tra loro diminuisce.

I componenti principali del microscopio ottico includono gli obiettivi, gli oculari, lo stadio del campione e il supporto del campione, la sorgente luminosa, il diaframma di campo, il condensatore e l'apertura e le manopole di messa a fuoco grossolane e fini.

Gli obiettivi sono responsabili della maggior parte dell'ingrandimento e della risoluzione del microscopio. Sono montati su un nasello rotante in modo tale che quando gli obiettivi vengono modificati, il piano focale rimane lo stesso - una proprietà denominata parafocalità. Un obiettivo può essere contrassegnato con l'ingrandimento, l'aperatura numerica, o N.A., il tipo di mezzo di immersione richiesto, lo spessore del coverslip che deve essere utilizzato quando si montano i campioni e la distanza di lavoro - la distanza dalla punta dell'elemento lente al piano focale nel campione.

L'apertura numerica, ancora una volta, definita come N.A., è una misura di quanto bene un obiettivo del microscopio può raccogliere luce. Gli obiettivi ad alto N.A. consentono il passaggio della luce ad angoli obliqui, mentre gli obiettivi N.A. bassi richiedono più luce diretta. La risoluzione di un obiettivo può essere calcolata dall'apertura numerica, data la lunghezza d'onda della luce.

La sorgente luminosa, il diaframma di campo, l'apertura e il condensatore sono tutti responsabili della produzione della luce e della sua consegna al campione.

La sorgente luminosa è in genere una lampadina alogena a bassa tensione che può essere regolata per controllare l'intensità della luce.

La luce passa quindi attraverso una varietà di filtri e nel diaframma di campo, che controlla l'area del campione da illuminare.

Il prossimo è il condensatore, che focalizza la luce sul campione, il cono di illuminazione attorno al campione è controllato dal condensatore e deve essere regolato a seconda dell'obiettivo utilizzato.

Per iniziare a utilizzare il microscopio ottico, posizionare un campione contenente la regione di interesse sul palco del microscopio, centrarlo direttamente sull'obiettivo e fissarlo in posizione utilizzando le clip del palcoscenico.

Quindi, accendere la sorgente luminosa e passare all'obiettivo più basso.

Quindi, focalizzare l'obiettivo a bassa potenza spostandolo nella direzione z utilizzando una regolazione iniziale della manopola di regolazione grossolana e quindi ruotando le manopole di regolazione fine per mettere a fuoco l'oggetto. Fare attenzione a non colpire la diapositiva o il palco con l'obiettivo in quanto ciò potrebbe danneggiare l'obiettivo.

Quindi, individua l'area di interesse guardando attraverso gli oculari mentre regoli le manopole per spostare la diapositiva nelle direzioni x e y. La dimensione del campo visivo diminuirà drasticamente man mano che si passa da un ingrandimento basso a un ingrandimento più elevato.

Centrare l'obiettivo con la potenza più bassa sull'area di interesse prima di passare a una potenza superiore aumenta notevolmente le possibilità di trovare il campione desiderato.

Una volta che il campione è stato posizionato a bassa potenza ed è a fuoco, passare all'obiettivo di potenza superiore che verrà utilizzato per l'acquisizione di immagini.

Ottimizza la qualità dell'illuminazione regolando prima il diaframma del campo in modo che il diaframma stesso sia appena fuori dal campo visivo.

Quindi, regolare il diaframma del condensatore in modo che le impostazioni corrispondano all'apertura numerica dell'obiettivo in uso.

Infine, regola di nuovo la messa a fuoco. Questa volta solo utilizzando la manopola di regolazione fine.

Ora sei pronto per scattare immagini del tuo campione.

La microscopia ottica ha il potenziale per visualizzare una vasta gamma di campioni e varie configurazioni del microscopio composto esistono per adattarsi a molte applicazioni diverse.

Qui, vedete un ricercatore che si prepara a lavorare al microscopio chirurgico. Questi microscopi sono generalmente sospesi su un braccio mobile e sono stereoscopici, il che significa che consentono alla luce di passare allo spettatore e anche a una telecamera montata sul microscopio. Questo microscopio chirurgico viene utilizzato in una procedura di trapianto di rene, nei topi.

In questa clip, si vede un ricercatore che guarda attraverso un microscopio di dissezione, mentre sceglie le larve di drosophila perfette per un'ulteriore dissezione , al fine di esporre i muscoli della parete del corpo in modo che la giunzione neuromuscolare possa essere studiata.

Qui puoi vedere un microscopio composto invertito, che ha un obiettivo sotto lo stadio, in preparazione per una tecnica di microiniezione. Questa procedura, nota come trasferimento nucleare di cellule somatiche, è un metodo importante per generare animali transgenici e creare cloni.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla microscopia ottica.

In questo video abbiamo esaminato: cos'è un microscopio e come funziona, i suoi numerosi componenti, come apportare modifiche a loro e come acquisire immagini di qualità. Grazie per l'attenzione!

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