Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
General Laboratory Techniques

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

מבוא למיקרוסקופיה קלה

Overview

מיקרוסקופ האור הוא מכשיר המשמש חוקרים בתחומים רבים ושונים להגדלת דגימות עד פי אלף מגודלן המקורי. בצורתו הפשוטה ביותר, הוא מורכב מעדשה ברורה המגדילה את המדגם ומקור אור כדי להאיר אותו. עם זאת, רוב המיקרוסקופים הקלים הם הרבה יותר מורכבים ומאכלסים עדשות רבות ומכוונונות היטב עם ממדים מבוקרים היטב כולם בתוך הגוף של המיקרוסקופ עצמו וברכיבים כגון המטרות והעיניים. בסרטון זה, הרכיבים העיקריים של מיקרוסקופ האור מתוארים והשימושים והפונקציות שלהם מוסברים בפירוט. עקרונות היסוד של הגדלה, מיקוד ורזולוציה מוצגים גם הם. פעולת מיקרוסקופ אור בסיסית מתחילה בהבאת אור לדגימה והבטחה שמקור האור הוא בעוצמה, כיווניות וצורה נכונים על מנת לייצר את התמונה האיכותית ביותר. לאחר מכן, יש להגדיל את המדגם כראוי ולהכניסו לפוקוס כדי להציג את אזור העניין. ישנם יישומים מעשיים רבים למיקרוסקופיה קלה כולל צפייה בתאים ורקמות מוכתמים או לא מזוהמים, פתרון פרטים קטנים של דגימות, ואפילו הגדלת אזור עניין במהלך הניתוח כדי לסייע בהליכים מורכבים בסולם המיקרון.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מיקרוסקופ האור הוא מכשיר המשמש להעצמת דגימות מחקר. מיקרוסקופים קלים הם כלי אנליטי רב ערך שיש לו פוטנציאל לאפשר לחוקרים מדעיים לצפות באובייקטים בגודל של פי 1000 מגודלם המקורי. כפי שתראו, מיקרוסקופ האור פועל באמצעות כמה עקרונות בסיסיים מאוד, אך יש לו יישומים כמעט בלתי מוגבלים להדמיית דגימות במעבדה.

כפי ששמו מרמז על מיקרוסקופ האור דורש מקור אור, אשר מייצר אור שניתן למקד, על ידי עדשת ממקד, על המדגם.

האור המאיר את הדגימה מגיע לעדשה המכונה העדשה האובייקטיבית, היוצרת תמונה מוגדלת הפוכה, או הפוכה. העינית, או העדשה העין, מגדילה עוד יותר את התמונה, שהעין מקבלת לאחר מכן. אלמנטים אופטיים נוספים יכולים להיות הציג לתוך נתיב האור כדי ימינה את התמונה, כך שהעין רואה אותו בכיוון הנכון. מיקרוסקופים המשתמשים בעדשות מרובות כמו זו שרואים כאן נקראים מיקרוסקופים מורכבים.

במיקרוסקופ מורכב, ההגדלה הכוללת מחושבת על ידי הכפלת ההגדלה של העדשה האובייקטיבית על ידי הגדלה של העדשה העין, או חתיכת העין. עם עדשה אובייקטיבית פי 40 ועדשה עינית פי 10, ההגדלה הכוללת היא פי 400.

כדי לסייע בהערכת גודל העצמים מתחת למיקרוסקופ, ניתן להשתמש בצמצם גלגל העין, ניתן להשתמש בקנה מידה המוקרן מעל התמונה. בהגדלה גבוהה יותר, סימוני השנתות בריסת העין ייצגו מרחקים קטנים יותר, מאשר בעת צפייה בהגדלות נמוכות יותר.

בנוסף להגדלה, היבט נוסף של אופטיקה מיקרוסקופ הוא רזולוציה. הרזולוציה מתייחסת למרחק הניתן לפתרון הקצר ביותר בין שני אובייקטים מתחת לטווח. ככל שראשי הדמויות האלה נעשים יותר ויותר ברורים, והרזולוציה גדלה, המרחק הניתן לצפייה הקצר ביותר ביניהם פוחת.

המרכיבים העיקריים של מיקרוסקופ האור כוללים את המטרות, את העיתים, את שלב הדגימה ואת מחזיק הדגימה, את מקור האור, את הסרעפת בשדה, את המעיסה והצמצם ואת ידיות המיקוד גסות והטובות.

המטרות אחראיות לרוב ההגדלה והרזולוציה של המיקרוסקופ. הם מותקנים על אף מסתובב באופן שככל שהמטרות משתנות, מישור המוקד נשאר זהה – נכס המכונה parafocality. ניתן לסמן מטרה עם ההגדלה, האפרטואר המספרי, או N.A., סוג מדיום הטבילה הנדרש, עובי כיסויים שיש להשתמש בו בעת הרכבה של דגימות, ומרחק העבודה - המרחק מקצה רכיב העדשה למישור המוקד במדגם.

הצמצם המספרי, שוב, המוגדר כ- N.A., הוא מדד של כמה טוב מטרה מיקרוסקופ יכול לאסוף אור. מטרות N.A. גבוהות מאפשרות לאור בזוויות עקפויות לעבור דרך בעוד מטרות N.A. נמוכות דורשות אור ישיר יותר. ניתן לחשב את הרזולוציה של מטרה מתוך הצמצם המספרי, בהתחשב אורך הגל של האור.

מקור האור, הסרעפת, הצמצם והמדחוס אחראים כולם על ייצור האור והעברתו לדגימה.

מקור האור הוא בדרך כלל נורת הלוגן במתח נמוך שניתן להתאים כדי לשלוט בעוצמת האור.

לאחר מכן עובר האור דרך מגוון מסננים אל תוך הסרעפת של השדה, השולטת באזור הדגימה כדי להיות מואר.

הבא הוא המדחוס, המתמקד בהיר, אור על הדגימה, חרוט התאורה סביב הדגימה נשלט על ידי המדחוס ויש להתאים בהתאם למטרה המשמשת.

כדי להתחיל להשתמש במיקרוסקופ האור, הנח מדגם המכיל את אזור העניין על במת המיקרוסקופ, מרכז אותו ישירות מעל המטרה, ואבטח אותו במקום באמצעות קליפי הבמה.

לאחר מכן, הפעל את מקור האור ועבור למטרה המופעלת בעוצמה הנמוכה ביותר.

לאחר מכן, למקד את המטרה בעוצמה נמוכה על ידי הזזתה בכיוון z באמצעות התאמה ראשונית של ידית ההתאמה גסה, ולאחר מכן סיבוב ידיות ההתאמה העדינות כדי להביא את האובייקט בפוקוס חד. יש להקפיד לא להכות את השקופית או שלב עם המטרה כמו זה יכול לפגוע בעדשה.

לאחר מכן, אתר את אזור העניין על-ידי התבוננות דרך חלקי העיניים תוך התאמת הכפתורים כדי להזיז את השקופית בכיווני x ו- y. גודל שדה הראייה יקטן באופן דרסטי בעת המעבר מהגדלה נמוכה, להגדלה גבוהה יותר.

מיקוד המטרה המונעת הנמוכה ביותר בתחום העניין לפני המעבר לכוח עליון מגדיל מאוד את הסיכויים למצוא את הדגימה הרצויה.

לאחר הדגימה כבר ממוקם בהספק נמוך והוא בפוקוס, לעבור ליעד כוח גבוה יותר שישמש לרכישת תמונות.

מטב את איכות התאורה על-ידי כוונון ראשון של הסרעפת של השדה כך שהסרעפת עצמה נמצאת ממש מחוץ לשדה הראייה.

לאחר מכן, התאם את הסרעפת של המרוכז כך שההגדרות יתאימו לצמצם המספרי של המטרה בשימוש.

לבסוף, להתאים את המוקד שוב. הפעם רק באמצעות ידית ההתאמה העדינות.

עכשיו אתה מוכן לצלם את הדגימה שלך.

למיקרוסקופיה קלה יש פוטנציאל לדמיין מגוון רחב של דגימות, ותצורות שונות של המיקרוסקופ המורכב קיימות כדי להתאים ליישומים רבים ושונים.

כאן, אתה רואה חוקר מתכונן לעבוד תחת מיקרוסקופ כירורגי. מיקרוסקופים אלה תלויים בדרך כלל על זרוע ניידת והם סטריאוסקופיים, כלומר הם מאפשרים לאור לעבור לצופה וגם מצלמה המותקנת על המיקרוסקופ. מיקרוסקופ כירורגי זה נמצא בשימוש בהליך השתלת כליה, בעכברים.

בסרטון זה, אתה רואה חוקר מסתכל דרך מיקרוסקופ מנתח, תוך כדי בחירת זחלי drosophila המושלמים עבור ניתוח נוסף , על מנת לחשוף את שרירי דופן הגוף כך הצומת neuromuscular ניתן ללמוד.

כאן אתה יכול לראות מיקרוסקופ מורכב הפוך, אשר יש מטרה מתחת לשלב, להיות מוכן לטכניקת microinjection. הליך זה, המכונה העברה גרעינית תא סומטי, הוא שיטה חשובה ליצירת בעלי חיים מהונדסים ויצירת שיבוטים.

הרגע צפית בהקדמה של ג'וב למיקרוסקופיה קלה.

בסרטון זה סקרנו: מהו מיקרוסקופ וכיצד הוא עובד, מרכיביו הרבים, כיצד לבצע התאמות אליהם וכיצד לרכוש תמונות איכותיות. תודה שצפיתם!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter