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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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PCR: A Reação da Cadeia de Polimerase

Overview

A reação em cadeia de polimerase, ou PCR, é uma técnica usada para amplificar o DNA através do termociclismo – ciles de temperatura mudam em intervalos de tempo fixos. Usando uma polimerase de DNA termoestável, o PCR pode criar numerosas cópias de DNA a partir de blocos de construção de DNA chamados dNTPs. Há três etapas no PCR: desnaturação, ressarcialização e alongamento. A desnaturação é o primeiro passo do ciclo e faz com que o DNA derreta, interrompendo as ligações de hidrogênio entre as bases resultando em DNA mono-encalhado. A ressarência reduz a temperatura o suficiente para permitir a ligação dos primers oligonucleotídeos ao modelo de DNA. Durante a etapa de alongamento, a polimerase de DNA sintetizará novo DNA de dupla cadeia.

Este vídeo fornece uma introdução ao procedimento PCR. Os princípios básicos do PCR são descritos, bem como um procedimento passo-a-passo para a configuração de uma reação pcr generalizada. O vídeo mostra os componentes necessários para uma reação de PCR, inclui instruções para o design do primer e fornece dicas úteis para garantir reações bem-sucedidas do PCR.

Procedure

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A reação em cadeia de polimerase ou PCR é um método amplamente utilizado para amplificar fragmentos de DNA. O PCR usa termociclismo, que é o aquecimento repetido e o resfriamento da reação através de três temperaturas distintas chamadas de denaturação, ressarcimento e extensão ou alongamento.

A reação termociclante começa quando os reagentes PCR são colocados em um termociclador de uma máquina, que é programada para aquecer precisamente e esfriar a reação.

O ciclo pcr começa com a desnaturação, que ocorre por 20 a 30 segundos a 95 °C, bem acima da temperatura de fusão do DNA. A temperatura de fusão é um estado onde metade do DNA é uma dupla hélice encalhada e a outra é uma única bobina aleatória encalhada. A temperatura de desnaturação está bem acima da temperatura de fusão, a fim de garantir que todas as ligações de hidrogênio entre pares de base complementares sejam quebradas produzindo apenas DNAs encalhadas únicas. Fios únicos emparelhados são denominados os fios sentido e antissense. A sequência do sentido, ou cadeia de codificação, é idêntica à sequência de mRNA, que em última análise codificará para proteína. Portanto, faz sentido. Quando lido da esquerda para a direita começa com o fosfato de 5' e termina com o hidroxila de 3'. A vertente antissense também é chamada de vertente complementar e começa com hidroxila de 3' e termina com o fosfato de 5' quando lido da esquerda para a direita.

No segundo passo, ressarem, pedaços curtos de DNA chamados primers, que são específicos para o sentido ou fios antissamo ligam através de ligações de hidrogênio. O primer que se liga à vertente antissense e tem a mesma sequência que a vertente do sentido é o primer para frente ou sentido. O primer que se liga à vertente do sentido e tem uma sequência que é inversa e complementar à vertente do sentido é a sua cartilha reversa ou anti-desamada. Dependendo do comprimento dos primers usados a temperatura de ressaramento para esta etapa é geralmente 3 a 5 °C abaixo da temperatura de fusão mais baixa de seus dois primers. O ressarem tende a ocorrer entre 50 e 65 °C e dura de 20 a 40 segundos.

Uma vez que os primers se ligam ao DNA, eles preparam a reação criando um fim de grupo hidroxilel de 3' para o qual uma polimerase, uma enzima que replica DNA, se ligará.

O próximo passo chamado alongamento ou extensão ocorre a 72 °C, o que é ideal para a atividade de polimerase. Uma vez ligada a polimerase começa a adicionar triptosfatos nucleotídeos livres, ou dNTPs, às extremidades do primer um de cada vez na direção de 5' a 3' para fazer DNA duplo encalhado.

Uma vez que o alongamento se completa, o próximo ciclo começa. No próximo ciclo, os primers se ligarão ao DNA único encalhado formado através de extensão anterior. O fragmento curto que você está tentando amplificar, o amplicon, finalmente se formará quando a polimerase se estender do primer dianteiro em um fio que foi gerado pela amplificação do primer reverso ou vice-versa. Uma vez gerada, a quantidade de amplicon aumentará exponencialmente nos ciclos subsequentes. Dependendo da meta de sua reação, serão necessários 20 a 40 ciclos.

Para amplicons longos, um passo final de alongamento é normalmente executado a 72 °C por 5 a 15 minutos, a fim de garantir que todo o DNA esteja duplamente encalhado. Normalmente, uma etapa final de ressarem a 4 °C é programada no termociclador como uma etapa de precaução para garantir que o DNA permaneça estável até que o DNA permaneça estável até que o termociclador.

A reação do PCR requer vários reagentes-chave. O primeiro é o modelo de DNA, que é a amostra de DNA da qual seu fragmento será amplificado. Depois há seus primers, que são os pedaços curtos de DNA ou oligonucleotídeos que prime a reação de polimerase.

Existem várias considerações importantes que precisam ser tomadas ao escolher seus primers. Primeiro, eles devem ser complementares às regiões de 5' e 3' do seu modelo de DNA que flanqueiam a sequência que você deseja amplificar. Em segundo lugar, eles devem ter entre 15 e 30 pares de base de comprimento e ser composto por cerca de 50% guaninas e citosinas. Em terceiro lugar, as temperaturas de fusão de ambos os primers devem ser acima de 50 °C e dentro de um a dois graus um do outro para que eles possam se ligar eficientemente na mesma temperatura de ressaramento. Em quarto lugar, eles não podem ser complementares um ao outro e formar dimers primer. E quinto, eles não devem conter estrutura secundária, que é forma por auto-annealing dentro de um dos primers.

Além dos primers e do modelo de DNA, a polimerase de DNA é essencial para a reação do PCR. A enzima mais usada no PCR é a polimerase Taq, que é uma enzima termotável isolada da bactéria Thermus aquaticus que faz sua casa em fontes termais. A polimerase taq pode suportar temperaturas superiores a 90 °C.

dNTPs, que comporão os pares de base nos fios em crescimento, também devem ser adicionados à reação. Um tampão de reação, que mantém pH e contém íons importantes como manganês, magnésio e potássio, também é um componente de reação necessário que estabiliza a reação e fornece cofatores importantes para a enzima polimerase. Como todas as reações, o PCR precisa de um solvente, e por isso a água de grau PCR, que está livre de íons que podem inibir a reação, é usada.

Antes de iniciar o PCR certifique-se de que o ambiente de trabalho está limpo para evitar contaminação. Luvas devem ser sempre usadas.

Para ajudar a acompanhar os vários componentes de reação que você precisará. Faça uma tabela de volumes de reagentes e concentrações para cada uma de suas amostras, incluindo controles. Em termos de volumes, uma reação típica deve conter 5μL de tampão de reação 10X, 4μL de 25 mM MgCl2, 1μL de dNTPs a 10 mM, 2μL de primers dianteiros e invertidos a 50 ng/μL e 0,3μL de polimerase Taq a 5 U/μL. Você quer adicionar modelo suficiente para que 100 ng esteja presente na reação. Finalmente, a maioria das reações de PCR são conduzidas em um volume total de 50μL. Assim, um volume de água de grau PCR deve ser usado para garantir que o volume total seja de fato, 50μL.

Uma vez que sua reação é planejada no papel monte seus reagentes no gelo.

Em seguida, adicione seus reagentes ao tubo PCR. Primeiro adicione água, depois seu modelo, seus primers, tampão, cloreto de magnésio e dNTPs, adicione a polimerase Taq por último e misture bem.

Depois que sua reação for configurar coloque sua amostra em um termociclador e inicie seu programa PCR. Resumidamente, partes da máquina consistem em um termobloco, onde o tubo ou placa PCR é inserido e sujeito a mudanças precisas de temperatura. Uma tampa aquecida, que previne a condensação para que nenhuma amostra seja perdida e uma interface com um display para a programação de temperaturas pcr e durações do ciclo. Sempre configure seu programa antes de montar a reação.

Uma vez que o termociclador tenha feito seu trabalho. Tire sua reação e verifique o produto PCR com eletroforese gel. Se o PCR for bem sucedido, você deve ver o amplicon no tamanho correto do par base.

E agora para algumas dicas úteis ao trabalhar com PCR. Quando você está tentando amplificar o mesmo produto PCR de vários modelos diferentes e, portanto, ter um monte de reações diferentes à configuração. É útil para aumentar a reação para criar uma mistura mestra. O mix mestre pcr é uma grande mistura de volume de todos os reagentes compartilhados entre suas amostras, que mais tarde é distribuído em múltiplos tubos de reação.

A maioria das reações do PCR começam com uma etapa inicial de desnaturação, que ocorre a 95°C por 1 a 9 minutos. Esta etapa garante que todo o modelo esteja encalhado para o primeiro ciclo de amplificação.

Muitas vezes é desejável usar um gabinete PCR quando o risco de contaminar sua amostra é alto. Para verificar se há alguma contaminação em sua reação é benéfico configurar um controle negativo, que não tem modelo de DNA e não deve produzir um produto em seu gel de DNA.

Muitas vezes o PCR deve ser otimizado ajustando temperaturas, concentração de cloreto de magnésio ou experimentando novos primers. Uma vez que você tenha seu PCR funcionando. É uma boa ideia sempre executar um modelo de controle positivo, que você sabe que vai produzir um produto.

Existem muitas variações e aplicações de PCR para uma variedade de propósitos.

Uma variação do PCR, pcr de partida quente, envolve reter a polimerase da reação até depois da primeira etapa de desnaturação, o que impede a amplificação inespecífica que pode ocorrer antes do ciclismo.

O PCR também pode ser modificado para amplificar simultaneamente várias sequências de DNA, empregando vários primers em uma única reação pcr chamada multiplex PCR.

Em combinação com sondas oligonucleotídeos fluorescentes, o PCR pode realmente se tornar uma técnica que pode medir níveis relativos ou absolutos de expressão genética ou quanto mRNA é produzido para um determinado gene ou grupo de genes. Este método é referido como qPCR.

PCR também pode ser usado para determinar a presença de uma sequência de DNA particular em um organismo. Este procedimento é referido como genotipagem. Por exemplo, a genotipagem pode ser usada para determinar a autenticidade das amostras de peixes, descobrindo se uma sequência específica da espécie está presente na amostra. Genotipagem também é usada em análise forense para determinar se o DNA encontrado na cena do crime corresponde a um suspeito.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE ao PCR. Neste vídeo revisamos o que é PCR e como ele funciona, os muitos componentes da reação pcr, o mecanismo pelo qual o PCR pode amplificar o DNA e as muitas variações e aplicações desta técnica altamente útil. Obrigado por assistir!

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