Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

טרנספורמציה חיידקית: אלקטרופורציה

Overview

המונח "טרנספורמציה" מתייחס בליעה תאית של DNA זר. בטבע, טרנספורמציה יכולה להתרחש בסוגים מסוימים של חיידקים. בביולוגיה מולקולרית, לעומת זאת, טרנספורמציה מושרה באופן מלאכותי באמצעות יצירת נקבוביות בקירות התא החיידקי. תאים חיידקיים המסוגלים לקלוט דנ"א מהסביבה נקראים תאים מוסמכים. תאים אלקטרו-קומפטנטיים יכולים להיות מיוצרים במעבדה וניתן להשיג טרנספורמציה של תאים אלה באמצעות יישום של שדה חשמלי היוצר נקבוביות בקיר התא שדרכו DNA יכול לעבור.

הסרטון מסביר את הציוד המשמש באלקטרופורציה כגון אלקטרופורטור ואקובט אלקטרופורציה. הסרטון גם עובר הליך שלב אחר שלב על איך ליצור תאים אלקטרו-קומפטנטיים ותאי אלקטרופוראט של עניין. חיזוי של ההצלחה של טרנספורמציה של ניסוי, על ידי התבוננות קבוע הזמן, כמו גם את החשיבות של הסרת מלח מן הפתרונות בעת אלקטרופורציה, מוזכרים גם.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

טרנספורמציה חיידקית היא תהליך טבעי, שבו חיידקים בולעים דנ"א זר ואז מגבירים או משכפלים אותו. במעבדה, תהליך זה יכול להיות מושרה באופן מלאכותי, באמצעות פולסים שדה חשמלי מתח גבוה כדי ליצור נקבוביות בקרום התא החיידקי, שדרכו DNA plasmid יכול לעבור. Electroporation מתייחס לשיטה זו והסרטון הבא ידגים את עקרונותיו, הליך שלב אחר שלב ויישומים.

לפני שנדבר על אלקטרופורציה של חיידקים, חשוב להבין את סוג הדנ"א המשמש בניסויים אלה: הפלסמיד. פלסמיד הוא פיסת דנ"א קטנה, מעגלית, חוץ-כרומוסומלית, הפועלת כווקטור, נושאת של רצף הדנ"א הספציפי שלך.

בין אם רצף זה הוא גן לחלבון פלואורסצנטי במדוזות או אנזים מצמחים, הוא מוחדר לפלסמיד דרך אזור הנקרא אתר השיבוט המרובה או MCS. אזור זה מכיל רצפים ספציפיים המבקעים על ידי אנדונקולאזים מגבילים או אנזימי הגבלה. ניתן להשתמש באותם אנזימי הגבלה כדי לחתוך את רצף העניין שלך, כך שהקצוות משלימים את הקצוות החתוכים החדשים של הפלסמיד.

Plasmids מכילים גם מקור של שכפול, ORI מקוצר, המציין את הנקודה שבה הוא ישוכפל. כשמדובר בטרנספורמציה הגן עמיד לאנטיביוטיקה הוא בעל חשיבות חיונית. כפי ששמו מרמז על גן זה מאפשר לחיידקים לייצר אנזים המנטרל אנטיביוטיקה המאפשרת להם לשרוד באנטיביוטיקה המכילה מדיה.

אלקטרופורציה עושה שימוש במכשיר מיוחד שנקרא אלקטרופורטור. בדרך כלל תאים ממוקמים לתוך cuvette אלקטרופורציה, אשר יש אלקטרודות בכל צד כי ליצור מגע חשמלי עם המכונה פעם מוכנס.

תאים חיידקיים מעורבבים עם DNA נטענים לתוך cuvette אלקטרופורציה ושדה חשמלי על הסדר 1000 עד 10,000 וולט לסנטימטר מוחל במשך כמה אלפיות השנייה. זה גורם למתח על פני הממברנה להגיע 0.5-1 וולט, אשר הוא האמין להוביל ארגון מחדש של bilayer פוספוליפיד הכולל את קרום התא כך נקבוביות ייווצרו. במצב זה DNA plasmid יעבור דרך הממברנה וכאשר פעימה הושלמה bilayer יתקן את עצמו.

לאחר שלקח את plasmid, חיידקים יכולים אז לגדול על לוחות אגר המכילים אנטיביוטיקה.

עכשיו שלמדנו על פלסמידים ומנגנון האלקטרופורציה. בואו נסתכל על איך ההליך מתנהל.

תאים שיכולים בקלות לקחת DNA מכונים תאים מוסמכים. הסוג הנפוץ ביותר של חיידקים מוסמכים שמשתנה במחקר ביולוגיה מולקולרית הוא E. coli, שהם החיידקים הפרוקריוטים שהופכים את ביתם במעי התחתון. E. coli המוכנים אלקטרופורציה מכונים תאים אלקטרו-קומפטנטיים.

בכל פעם שאתם מטפלים בחיידקים, ודאו שאזור העבודה נקי ככל האפשר.

טיפול בחיידקים דורש גם טכניקה אספטית בפועל אחת. בדרך כלל זה כרוך בשימוש במבער Bunsen כדי לעקר מכשירים וליצור זרם convection - אשר שומר מזהמים באוויר הרחק מסביבת העבודה.

מיד לפני אלקטרופורציה, מדיה חמה מראש לטמפרטורת החדר, להביא לוחות אגר המכילים אנטיביוטיקה ל 37 מעלות צלזיוס, ו cuvettes אלקטרופורציה מגניב על קרח.

לאחר מכן, להפשיר תאים אלקטרו-קומפטנטיים שטפו על קרח.

מוסיפים 1-5uL של פלסמיד קר 1ng/μL שהוא ללא מלח לתאי חיידקים, מערבבים בעדינות ומוסיפים את התערובת לתערובת הקרה. תוודא שאין בועות.

הגדר את המתח ואת עוצמת השדה של האלקטרופורטור להגדרות הנכונות עבור התאים שלך. כאן אתה רואה אלקטרופורטור מוגדר 1700 וולט ומפיק כוח שדה של 17kV / ס"מ.

נגב את החלק החיצוני של הקובט יבש והכניס אותו לתוך האלקטרופורטור. פעם את התאים עד שאתה שומע צפצוף.

פעימה לא מוצלחת גורמת לפריקה חשמלית, אשר ניתן להבחין כמו ניצוץ גלוי פופ נשמע. פריקה זו, המכונה קשתות, יכולה להיות תוצאה של יותר מדי מלח בתאים המוכשרים שלך או DNA.

ניתן לחזות את הצלחת השינוי שלך על ידי ציין את קבוע הזמן, שהוא משך הזמן שלוקח למתח להתפורר לאחר החלת הדופק. כאשר מלח קיים ואת פתרון electroporation הוא מוליך מאוד, הריקבון קורה במהירות, גרימת הפריקה, ובכך להרוג רבים של התאים שלך. עבור חיידקים, קבועי זמן טובים נעים בין 5-10 אלפיות השנייה.

מיד לאחר פעימות, להסיר את cuvette ולהוסיף 1 מ"ל של מדיה ישירות לתאים. תא זה המכיל מדיה ממוקם בצינור ודגורה ב 37 °C במשך 1 שעה, עם רועד, על מנת התאים להתאושש.

לאחר מכן, באמצעות טכניקה אספטית להוסיף 20-200uL של התא לאנטיביוטיקה המכילה צלחת אגר. הפוך את הצלחות כך אגר הוא על גבי ולכן עיבוי לא נופל לתוך התאים שלך לדגורת לילה ב 37 מעלות צלזיוס.

חיידקים שעברו טרנספורמציה עם הפלסמיד אמורים ליצור מושבות. לספור את המושבות ולחשב את יעילות הטרנספורמציה, שהוא מספר טרנספורמטים מוצלחים חלקי הכמות הכוללת של DNA מצופה.

אגר ומדיה, המספקים את התזונה עבור החיידקים שלך, צריך להיות מוכן מראש מעוקר באמצעות autoclaving. אפשרו למדיה נוזלית להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש ולתת לאגר להתקרר ל-50-55 מעלות צלזיוס – הטמפרטורה שבה ניתן להוסיף אנטיביוטיקה ולשפוך צלחות. לאחר מכן, אפשר לצלחות להתקרר לטמפרטורת החדר כדי להתמצק.

מאז חיידקים המשמשים טרנספורמציה מאוחסנים במקפיא, הם חייבים להיות מופשרים תחילה על קרח, להתפשט על צלחת אגר ללא אנטיביוטיקה ולאחר מכן גדל לילה ב 37°C.

באמצעות טכניקה אספטית לבחור מושבה חיידקית מן צלחת אגר ולהגדיל אותו בתרבות גדולה יותר 500mL לילה ב 37 °C באינקובטור רועד.

בזמן שהתאים גדלים, להכין על ליטר מים deionized ולהוות 10% גלילצל ומים, נפח לפתרון נפח. יש לאבודד את הפתרונות ולתת להם להתקרר ב-4°C.

מדידות ספיגה משמשות כדי לקבוע אם החיידקים נמצאים בשלב אמצע יומן הצמיחה שלהם, מה שאומר שהם בקלות לקחת DNA. ברגע שהתאים הגיעו לשלב זה, הנח אותם על קרח ולשמור אותם שם לאורך כל ההליך.

לאחר מכן, לשטוף תאים על ידי הפרדתם בשני צינורות צנטריפוגה גדולים להסתובב ב 4 מעלות צלזיוס, לשפוך את supernatant ו resuspend במים סטריליים 100mL עקר. חזור על שלב זה לפחות עוד פעם אחת. מטרת צעד זה היא להסיר מלח, אשר ישפיע מאוד על טכניקת electroporation.

בצע שתי שטיפות נוספות ב 50 מ"ל של 10% גלילצל במים ולבסוף resuspend החיידקים באותה פתרון.

הוסף 50μL של תאים לתוך צינורות אפנדורף מרובים. תאים אלה מוכנים כעת לשימוש אלקטרופורציה ויש לשמור על 4°C. או שהם יכולים להיות קפואים מהבהבים ומאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס.

כפי שאתה עומד לראות, אלקטרופורציה יש יישומים רבים.

חלופה לאלקטרופורציה היא טרנספורמציה של הלם חום, הנשענת על חשיפת החיידקים הן לסידן כלוריד והן לחום על מנת להכניס DNA לתאים שלך.

באופן כללי, הלם חום הוא עדין יותר על החיידקים שלך מאשר אלקטרופורציה ואינו דורש מלח נמוך. תגובות קשירה, אלה הכרוכות בהכנסת גן היעד שלך לתוך plasmid, ניתן להשתמש ישירות טרנספורמציה הלם חום. טרנספורמציית הלם חום זולה יותר מאלקטרופורציה ולא מסתמכת על ציוד יקר או cuvettes. מצד שני, הלם חום מוביל ליעילות טרנספורמציה נמוכה יותר מאשר אלקטרופורציה ולוקח יותר זמן. כמו כן הוא מוגבל חיידקים, שמרים ופרוטופלסטים צמחיים בעוד אלקטרופורציה ניתן להחיל על תאים יונקים.

כאן אתה רואה פיברובלסטים עובריים של עכבר נטענים לתוך cuvette אלקטרופורציה. לאחר השלמת האלקטרופורציה, יעילות הטרנספורמציה יכולה להיקבע על ידי התבוננות במידת החלבון הפלואורסצנטי הירוק המקודד על ידי הפלסמיד. טרנספקטיון הוא המונח שניתן לשינוי של תאי יונקים, אשר בדרך כלל דורש עוצמות שדה נמוכות יותר מאשר תאים חיידקיים וקבועי זמן גבוהים יותר.

אלקטרופורציה יכולה להתבצע גם בבעלי חיים שלמים כמו עובר העוף המתפתח שראית כאן. DNA Plasmid מוזרק למוחו של האפרוח ולאחר מכן בדיקה אלקטרופורציה משמשת כדי להחיל שדה חשמלי על רקמת המוח. לאחר יום או יומיים, חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים ואדומים - המקודדים על ידי הפלסמיד - מיוצרים על ידי נוירונים, ומדענים יכולים לצפות בשינויים מבניים במוח האפרוח המתפתח.

הרגע צפיתם בהקדמה של JoVE לשינוי חיידקי על ידי אלקטרופורציה. וידאו זה הציג את הפלסמיד כסוג ה- DNA הנפוץ ביותר, דן במנגנון הביופיסי שנחשב כבסיס לאלקטרופורציה, הראה הליך כללי לביצוע אלקטרופורציה, ותיאר כיצד ניתן להשתמש באלקטרפורציה במערכת היונקים. תודה שצפיתם!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter