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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Trasformazione batterica: elettroporazione

Overview

Il termine "trasformazione" si riferisce all'ingestione cellulare di DNA estraneo. In natura, la trasformazione può avvenire in alcuni tipi di batteri. In biologia molecolare, tuttavia, la trasformazione è indotta artificialmente attraverso la creazione di pori nelle pareti cellulari batteriche. Le cellule batteriche che sono in grado di prendere il DNA dall'ambiente sono chiamate cellule competenti. Le celle elettrocompetenti possono essere prodotte in laboratorio e la trasformazione di queste cellule può essere ottenuta attraverso l'applicazione di un campo elettrico che crea pori nella parete cellulare attraverso i quali il DNA può passare.

Il video spiega le apparecchiature utilizzate nell'elettroporazione come un elettroporatore e una cuvetta di elettroporazione. Il video passa anche attraverso una procedura passo-passo su come creare celle elettrocompetenti e celle elettroporate di interesse. Viene anche menzionata la previsione del successo di una trasformazione di un esperimento, osservando la costante di tempo, nonché l'importanza di rimuovere il sale dalle soluzioni durante l'elettroporazione.

Procedure

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La trasformazione batterica è un processo naturale, in cui i batteri ingeriscono DNA estraneo e poi lo amplificano o lo clonano. In laboratorio, questo processo può essere indotto artificialmente, utilizzando impulsi di campo elettrico ad alta tensione per creare pori nella membrana cellulare batterica, attraverso i quali può passare il DNA plasmidico. L'elettroporazione si riferisce a questo metodo e il seguente video ne dimostrerà i principi, la procedura passo-passo e le applicazioni.

Prima di parlare di elettroporazione dei batteri, è importante capire il tipo di DNA utilizzato in questi esperimenti: il plasmide. Un plasmide è un piccolo, circolare, extracromosomiale pezzo di DNA che agisce come un vettore, un vettore della sequenza di DNA specifica.

Sia che questa sequenza sia un gene per una proteina di fluorescenza nelle meduse o un enzima dalle piante, viene inserita nel plasmide attraverso una regione chiamata sito di clonazione multipla o MCS. Questa regione contiene sequenze specifiche che sono scisse da endonucleasi di restrizione o enzimi di restrizione. Gli stessi enzimi di restrizione possono essere utilizzati per ritagliare la sequenza di interesse in modo che le estremità siano complementari alle estremità appena tagliate del plasmide.

I plasmidi contengono anche un'origine di replicazione, abbreviata ORI, che indica il punto in cui verrà replicata. Quando si tratta di trasformazione, il gene della resistenza agli antibiotici è di vitale importanza. Come suggerisce il nome, questo gene consente ai batteri di produrre un enzima che neutralizza l'antibiotico permettendo loro di sopravvivere in mezzi contenenti antibiotici.

L'elettroporazione fa uso di un dispositivo specializzato chiamato elettroporatore. Tipicamente le celle sono collocate in una cuvetta di elettroporazione, che ha elettrodi su ciascun lato che entrano in contatto elettrico con la macchina una volta inserita.

Le cellule batteriche mescolate con il DNA vengono caricate nella cuvetta di elettroporazione e un campo elettrico nell'ordine da 1000 a 10.000 volt per centimetro viene applicato per pochi millisecondi. Ciò fa sì che la tensione attraverso la membrana raggiunga 0,5-1 volt, che si ritiene porti a un riarrangiamento del doppio strato fospolipidico che comprende la membrana cellulare in modo tale che si formino i pori. In questo stato il DNA plasmidico passerà attraverso la membrana e quando la pulsazione è completa il doppio strato si riparerà da solo.

Dopo aver assorbito il plasmide, i batteri possono quindi crescere su piastre di agar contenenti antibiotici.

Ora che abbiamo imparato a conoscere i plasmidi e il meccanismo di elettroporazione. Diamo un'occhiata a come viene condotta la procedura.

Le cellule che possono facilmente assumere il DNA sono indicate come cellule competenti. Il tipo più comune di batteri competenti che viene trasformato nella ricerca di biologia molecolare è E. coli, che sono i batteri procariotici che fanno la loro casa nell'intestino inferiore. E. coli che sono preparati per l'elettroporazione sono indicati come celle elettrocompetenti.

Ogni volta che maneggiare batteri, assicurarsi che l'area di lavoro sia il più pulita possibile.

La manipolazione dei batteri richiede anche che si pratichi la tecnica asettica. In genere ciò comporta l'uso di un bruciatore Bunsen per sterilizzare gli strumenti e creare una corrente di convezione, che mantiene i contaminanti presenti nell'aria lontani dallo spazio di lavoro.

Immediatamente prima dell'elettroporazione, preriscaldare i mezzi a temperatura ambiente, portare le piastre di agar contenenti antibiotico a 37 ° C e raffreddare le cuvette di elettroporazione sul ghiaccio.

Successivamente, scongelare le celle elettrocompetenti lavate sul ghiaccio.

Aggiungere 1-5uL di plasmide freddo 1ng / μL privo di sale alle cellule batteriche, mescolare delicatamente e aggiungere la miscela alla cuvetta fredda. Assicurati che non ci siano bolle.

Impostare la tensione e l'intensità di campo dell'elettroporatore sulle impostazioni corrette per le celle. Qui si vede un elettroporatore impostato a 1700 volt e che produce un'intensità di campo di 17 kV / cm.

Asciugare l'esterno della cuvetta e metterlo nell'elettroporatore. Pulsare le cellule fino a sentire un segnale acustico.

La pulsazione infruttuosa provoca una scarica elettrica, che è osservabile come una scintilla visibile e un pop udibile. Questa scarica, indicata come arco, può essere il risultato di avere troppo sale nelle cellule competenti o nel DNA.

Il successo della tua trasformazione può essere previsto notando la costante di tempo, che è la durata necessaria affinché la tensione decada dopo aver applicato l'impulso. Quando il sale è presente e la soluzione di elettroporazione è molto conduttiva, il decadimento avviene rapidamente, causando la scarica e quindi uccidendo molte delle cellule. Per i batteri, le costanti di tempo buone vanno da 5-10 millisecondi.

Subito dopo la pulsazione, rimuovere la cuvetta e aggiungere 1 ml di media direttamente alle cellule. Questa cellula contenente il mezzo viene posta in un tubo e incubata a 37 ° C per 1 ora, con agitazione, in modo che le cellule si riprendano.

Quindi, usando la tecnica asettica aggiungere 20-200uL della cellula a una piastra di agar contenente antibiotico. Invertire le piastre in modo che l'agar sia in cima e in modo che la condensa non cada nelle cellule e incubare durante la notte a 37 ° C.

I batteri trasformati con il plasmide dovrebbero formare colonie. Conta le colonie e calcola l'efficienza di trasformazione, che è il numero di trasformanti di successo diviso per la quantità totale di DNA placcato.

L'agar e i mezzi, che forniscono la nutrizione per i batteri, devono essere pre-preparati e sterilizzati tramite autoclave. Lasciare raffreddare i liquidi a temperatura ambiente prima dell'uso e lasciare raffreddare l'agar a 50-55 ° C - la temperatura alla quale è possibile aggiungere antibiotico e versare le piastre. Quindi, lasciare raffreddare le piastre a temperatura ambiente per solidificare.

Poiché i batteri utilizzati nella trasformazione vengono conservati nel congelatore, devono prima essere scongelati sul ghiaccio, sparsi su una piastra di agar senza antibiotici e poi coltivati durante la notte a 37 ° C.

Usando la tecnica asettica selezionare una colonia batterica dalla piastra di agar e coltivarla in una coltura più grande di 500 ml durante la notte a 37 ° C in un incubatore vibrante.

Mentre le cellule crescono, preparare circa un litro di acqua deionizzata e costituisce una soluzione di glicerolo e acqua al 10%, volume per volume. Autoclave le soluzioni e lasciarle raffreddare a 4°C.

Le misurazioni dell'assorbanza vengono utilizzate per determinare se i batteri sono o meno nella loro fase di crescita media, il che significa che assorbiranno prontamente il DNA. Una volta che le cellule hanno raggiunto questa fase, metterle sul ghiaccio e tenerle lì durante la procedura.

Quindi, lavare le cellule separandole in due grandi tubi centrifughi e girare a 4 ° C, versare il surnatante e riconsoscie in acqua deionizzata sterile fredda da 100 ml. Ripetere questo passaggio almeno un'altra volta. Lo scopo di questo passaggio particolare è quello di rimuovere il sale, che influenzerà fortemente la tecnica di elettroporazione.

Eseguire due ulteriori lavaggi in 50 ml di glicerolo al 10% in acqua e infine risospenare i batteri in questa stessa soluzione.

Aggiungere 50μL di cellule in più tubi Eppendorf. Queste celle sono ora pronte per l'uso in elettroporazione e devono essere mantenute a 4°C. Oppure possono essere congelati e conservati a -80 ° C.

Come stai per vedere, l'elettroporazione ha molte applicazioni.

Un'alternativa all'elettroporazione è la trasformazione da shock termico, che si basa sull'esposizione dei batteri sia al cloruro di calcio che al calore per introdurre il DNA nelle cellule.

In generale, lo shock termico è più delicato sui batteri rispetto all'elettroporazione e non richiede poco sale. Le reazioni di legatura, quelle che comportano l'inserimento del gene bersaglio nel plasmide, possono essere utilizzate direttamente nella trasformazione dello shock termico. La trasformazione da shock termico è più economica dell'elettroporazione e non si basa su costose attrezzature o cuvette. D'altra parte, lo shock termico porta a minori efficienze di trasformazione rispetto all'elettroporazione e richiede più tempo. Inoltre è limitato a protoplasti batterici, lieviti e vegetali mentre l'elettroporazione può essere applicata alle cellule di mammifero.

Qui si vedono fibroblasti embrionali di topo che vengono caricati in una cuvetta di elettroporazione. Una volta completata l'elettroporazione, le efficienze di trasformazione possono essere determinate osservando la misura in cui le cellule producono una proteina di fluorescenza verde codificata dal plasmide. La trasfezione è il termine dato alla trasformazione delle cellule di mammifero, che in genere richiede forze di campo inferiori rispetto alle cellule batteriche e costanti di tempo più elevate.

L'elettroporazione può anche essere eseguita in animali interi come l'embrione di pollo in via di sviluppo che hai visto qui. Il DNA plasmidico viene iniettato nel cervello del pulcino e quindi viene utilizzata una sonda di elettroporazione per applicare un campo elettrico al tessuto cerebrale. Dopo un giorno o due, le proteine fluorescenti verdi e rosse - codificate dal plasmide - sono prodotte dai neuroni e gli scienziati possono osservare cambiamenti strutturali nel cervello del pulcino in via di sviluppo.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla trasformazione batterica mediante elettroporazione. Questo video ha introdotto il plasmide come il tipo di DNA più comunemente trasformato, ha discusso il meccanismo biofisico che si pensa sia alla base dell'elettroporazione, ha mostrato una procedura generalizzata per condurre l'elettroporazione e ha descritto come l'elettroporazione può essere utilizzata nel sistema dei mammiferi. Grazie per l'attenzione!

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