Protocole rapide pour la préparation de électrocompétentes

L'objectif général de cette procédure est de produire rapidement et commodément des bactéries compétentes le même jour. Ces bactéries sont nécessaires pour la transformation. Cette opération s'effectue en semant d'abord les bactéries sur un milieu gélosé LB et en les incubant pendant quatre à six heures.

Ensuite, la pellicule bactérienne est soigneusement prélevée à la surface de l'agar et le culot est resuspendu dans de l'eau froide stérile ou dans un tampon. Puis, le culot bactérien est lavé trois fois à quatre degrés Celsius et resuspendu dans 40 microlitres. Enfin, les cellules compétentes sont électroporées en présence d'ADN.

En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent des niveaux de transformation bactérienne comparables à ceux obtenus avec la méthode traditionnelle, qui nécessite un équipement considérable, de grands volumes de cultures bactériennes et des tampons stériles. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que des bactéries compétentes fraîches peuvent être préparées pratiquement à partir de n'importe quelle souche de laboratoire le jour même où la transformation est prévue, sans avoir besoin de grandes centrifugeuses, de rotors ou de grandes quantités de tampons et de cultures stériles. Généralement, les personnes novices dans cette méthode n'auront pas beaucoup de difficultés, car il s'agit simplement d'une variante accélérée de techniques couramment utilisées dans les laboratoires de bactériologie. L'auteur original de ce protocole ne peut pas être identifié, car il a été utilisé et optimisé par de nombreux chercheurs au fil du temps.

La méthode présentée ici est utilisée dans nos laboratoires depuis près de deux décennies, et notre objectif est de partager ce protocole utile avec nos collègues. La démonstration visuelle de cette méthode est importante pour une étape particulière, notamment le prélèvement des bactéries à partir de la pellicule sur la vis sans fin, car cela nécessite un œil expérimenté pour évaluer la croissance sur la boîte de Petri.

Et ceci est mieux visualisé. La procédure est démontrée par Mme Theresa Brooks, assistante de recherche du laboratoire du Dr Te Koski à l'Université de l'Alberta à Edmonton, au Canada. Pour commencer la préparation de la culture bactérienne en fin d'après-midi, utiliser une petite quantité d’E. coli ou de V. coray pour ensemencer un à cinq millilitres de bouillon LB stérile autoclavé dans des tubes à essai en verre borosilicaté stériles.

Placer les tubes de culture inoculés dans un rouleau tournant et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius et à grande vitesse. Préparer un répartiteur de cellules en forme de bâton de hockey à partir d'une tige en verre en chauffant le milieu de la tige à la flamme d'un bec Bunsen jusqu'à ce que le verre ramollisse. Puis utiliser des pinces ou des pinces plates pour orienter doucement le pliage selon un angle de 135 degrés.

Chauffez à nouveau la tige à son milieu, entre l’extrémité et le premier coude, puis pliez-la vers l’intérieur selon un angle de 45 degrés. Préparez du milieu LB, avec et sans antibiotiques, et conservez-le à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin.

Plaquez 100 microlitres de culture ensemencée la veille sur chaque boîte de gélose LB. À l’aide du repartiteur cellulaire, incubez la boîte à 37 degrés Celsius pendant quatre à six heures, ou jusqu’à l’apparition d’une pellicule mince de croissance bactérienne. À l’aide d’un anneau d’ensemencement, prélèvez une masse bactérienne d’environ deux millimètres de diamètre sur la boîte et resuspendez-la dans un millilitre d’eau glacée.

Chlorure de calcium à deux millimolaire. Si l'on utilise du v coray ou de l'eau doublement distillée stérile pour les e coli, à l'aide d'une centrifugeuse réfrigérée réglée à quatre degrés Celsius, centrifuger la suspension pendant cinq minutes à 5 000 G. Éliminer le surnageant et répéter le lavage deux fois supplémentaires. Après avoir éliminé le dernier surnageant, resuspendre le culot dans 40 microlitres de chlorure de calcium ou d'eau doublement distillée et maintenir sur glace.

Pour effectuer une transformation, ajoutez jusqu’à un microgramme d’ADN plasmidique à la suspension bactérienne de 40 microlitres, puis transférez le mélange dans une cuvette stérile préalablement refroidie de 0,2 centimètre d’écartement. Insérez la cuvette dans la chambre d’électroporation du module de commande d’impulsion et appliquez une impulsion de 1,8 kilovolt et 25 microsecondes. La constante de temps doit être d’environ 5,0 millisecondes et aucun arc électrique ne doit se produire.

Resuspendez rapidement les cellules dans un millilitre de bouillon LB et transférez-les dans un tube en verre stérilisé au préalable par autoclavage. Laissez les cellules se recouvrer en les incubant dans des conditions de croissance aérées à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, sans sélection par antibiotique. Ensemencez les bactéries sur des géloses LB contenant un antibiotique et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius.

Comme illustré ici, nous avons réalisé une série de transformations avec E. coli et V. corray afin de comparer l'efficacité de transformation de notre méthodologie rapide à une adaptation de la méthode traditionnelle initialement décrite par Döer et al. pour la préparation de bactéries électrocompétentes. Le rendement de transformants se situait entre 10⁶ et 10⁷ UFC par microgramme d'ADN au cours de trois expériences répétées pour E. coli et V. corray, en utilisant la méthode traditionnelle pour l'électrocompétence.

Préparation des cellules, le rendement des transformants est apparu diminué d’un facteur dix, de 10 à la puissance cinq à 10 à la puissance six UFC par microgramme d’ADN, dans trois expériences répétées pour E. coli et V. coray, en utilisant la méthode rapide. Pour cette raison, nous avons déterminé le pourcentage de bactéries transformées en divisant le nombre d’UFC transformées par le nombre d’UFC obtenues à partir de transformations témoins réalisées à partir de lots de cellules compétentes autrement identiques. Le pourcentage de bactéries transformées était compris dans un ordre de grandeur.

Indépendamment de la méthode de préparation et de l'espèce transformée. Ces résultats indiquent que l'efficacité de la méthode rapide est comparable à celle de la procédure traditionnelle plus longue de préparation de cellules compétentes, et que les souches représentatives de ieo, coray et esia coli répondent de manière équivalente à la procédure rapide. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq à six heures, si elle est exécutée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de récolter les bactéries durant leur phase de croissance logarithmique, de les laver dans une solution tamponnée stérile, fraîchement préparée et prérefroidie, et de les maintenir au froid jusqu'à leur resuspension dans du milieu LB après l'électroporation. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure de comprendre facilement comment générer rapidement des cellules bactériennes électrocompétentes spécifiques à une souche dans votre laboratoire, en les cultivant sur une pelouse initiale, en les récoltant durant la phase de croissance logarithmique, puis en les lavant dans un tampon froid en vue de l'électroporation.