תוספת תזונתית של חומצות שומן רב בלתי רוויות ב Elegans Caenorhabditis

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש באמצעים תזונתיים כדי לשנות את הרכב חומצות השומן של אלגנטיות הים על מנת לחקור את תפקוד וויסות חומצות השומן. זה מושג על ידי טיפוח מקור המזון של הנמטודה בנוכחות חומצות שומן בלתי רוויות. לאחר מכן, אלגנטיות הים מוזנים בחיידקים התוספים המאפשרים ספיגת חומצת השומן ושילובם בתולעת.

לאחר מכן השומנים משתנים באלגנטיות הים. הרכב חומצות השומן מאושר על ידי ניתוח ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיית גז. לבסוף, לאחר שניזונו מחומצות שומן בלתי רוויות, התולעים נקבעות לסטריליות.

מתקבלות תוצאות המראות את ההשפעות הפיזיולוגיות של שינוי בהרכב חומצות השומן באמצעות התנהגות התפתחותית, ושינויים בביטוי הגנים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי התפתחות אלגנטיות הים והפיזיולוגיה מכיוון שאנו יכולים להשתמש הן במניפולציה גנטית והן בתרומות תזונתיות כדי לשנות את הרכב חומצות השומן ולעקוב אחר ההשלכות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו חייבים להיות זהירים וזהירים מכיוון שקשה להשיג תוצאות עקביות בשל הרגישות של חומצות שומן בלתי רוויות לחמצן ולטמפרטורות גבוהות.

להכנת ליטר אחד של מדיום בתוספת חומצות שומן, מדוד את המרכיבים הבאים לבקבוק. הוסף מיליפור-מים עד 800 מיליליטר ובצע חיטוי של המדיום יחד עם בקבוק זכוכית ריק לכל ריכוז חומצות שומן לבדיקה, כמו גם צילינדרים מדורגים מתאימים בזמן שהמדיום מתקרר ב-55 מעלות צלזיוס. הכן את תמיסת מלאי העבודה של מלח הנתרן של חומצת השומן על ידי שבירת בקבוקון הזכוכית בזהירות כדי לא להכניס חלקיקי זכוכית לאבקה ושקילה מספיק כדי ליצור תמיסת מלאי של 100 מילימולרית להוסיף את הכמות הדרושה של מים מטוהרים.

לאחר מכן, באמצעות גז ארגון או חנקן, יש לטהר את התמיסה כדי למנוע חמצון חומצות שומן. לאחר מכן מכסים את הבקבוקון ומאחסנים את הבקבוקון בחושך בזמן שחומצת השומן, מלח הנתרן מתמוסס. כאשר החקלאות התקררה ל-55 מעלות צלזיוס לאחר מכן, אז ליד להבה, העבירה את התמיסה לגליל מדורג סטרילי.

לפני שמוסיפים מים סטריליים עד ליטר, מעבירים את המדיום בחזרה לבקבוק וממשיכים לערבב. השתמש בגליל מדורג סטרילי כדי להעביר כמות של מדיום לבקבוק חיטוי אחד עבור כל ריכוז חומצות שומן שייבדק. ואז לשמור על הבקבוקים חמים על צלחת ערבוב.

מערבבים פנימה את הריכוז המתאים של תמיסת מלאי חומצות שומן לפני השימוש בפיפטה סטרילית של 25 מיליליטר כדי לשפוך את הצלחות לאחר שהצלחות התמצקו, לכסות ולאחסן אותה בטמפרטורת החדר באזור שנבדק היטב בחושך. יומיים לאחר מכן, השתמש ב- e coli OP 50 כדי לזרוע את הצלחות, ולאחר מכן דגר את הצלחות בסביבה חשוכה בטמפרטורת החדר בזמן שהדשא החיידקי מתייבש. הכן אוכלוסייה מסונכרנת של זחלי L אחד על ידי טיפול בהרמפרודיטים של ראווי בתמיסת היפוכלוריט אלקליין.

נדנד בעדינות את הרמפרודיטים GR בתמיסה זו עד שהתולעים הבוגרות מתמוססות. ואז צנטריפוגה במהירות נמוכה כדי לגלול את הביצים. השתמש במאגר M nine כדי לשטוף את הביצים שלוש פעמים.

ואז בצינור של 15 מיליליטר, השעו אותם מחדש בחמישה מיליליטר של M nine buffer וסלע למשך הלילה. הוסיפו את זחלי L one לצלחות זרעים של OP 50 שנוספו להן חומצה די הומו גמלין של 0.3 מילי-מולרית או DGLA ודגרו אותן בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים או עד שהזחלים מגיעים לשלב הבוגר. השתמש במיקרוסקופ מנתח כדי לדרג תולעים בוגרות לעקרות.

אובדן חיידקים מוצלח יופיע כרחם צלול נטול ביציות. לחלופין, קלעו תולעים על ידי ליקוט אותן לטיפה של M nine buffer על זכוכית שעון. לאחר מכן השתמש במיליליטר אחד של 0.2 ננוגרם לתמיסה מטופשת כדי להציף את זכוכית השעון ולדגור כחמש דקות.

לאחר הדגירה, בחרו את התולעים לטיפה של מדיום הרכבה על מגלשה לפני הכיסוי בהחלקת כיסוי, אטמו את החלקת הכיסוי ואחסנו בארבע מעלות צלזיוס בחושך למשך הלילה או צפו מיד תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לייצר אסטרי מתיל של חומצות שומן או תהילות. כדי לכמת את ספיגת חומצות השומן, אספו 500 עד 1000 תולעים בוגרות על ידי שימוש במים כדי לשטוף אותן מהצלחות ולהעביר אותן לסיליקון. צינורות בורג זכוכית 13 על 100 מילימטר.

תנו לתולעים להתיישב על ידי כוח הכבידה ואז השתמשו בזכוכית מעבר לפיפטה כדי להסיר כמה שיותר מים. הוסף מיליליטר אחד של חומצה גופרתית 2.5% במתנול וחמם את הצינורות באמבט מים ב-70 מעלות צלזיוס למשך שעה לאחר קירור במשך דקה מתחת למכסה המנוע, חלץ את המסגרות על ידי הוספת 1.5 מיליליטר מים ו-0.25 מיליליטר הקסאן. יש לסגור את הצינורות ולנער במרץ.

לאחר מכן צנטריפוגה את הצינורות בצנטריפוגה קלינית על השולחן למשך דקה אחת כדי להפריד את ההקסאן מהממס הימי. העבירו את שכבת ההקסאן העליונה לכרומטוגרפיה של גז או לתוספת בקבוקון GC בתוך בקבוקון GC. כדי לנתח על ידי gc, הזרקו 1-2 מיקרוליטר של תהילה על עמוד כרומטוגרפיית גז נימי קוטבי המתאים לניתוח תהילה.

הגדר את המזרק על 250 מעלות צלזיוס עם קצב זרימה של 1.4 מיליליטר לדקה. תכנת את התנור לטמפרטורה התחלתית של 130 מעלות צלזיוס המוחזק למשך דקה אחת. לאחר מכן העלה את הטמפרטורה ב-10 מעלות צלזיוס לדקה עד שהיא מגיעה ל-190 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הגביר אותה שוב בחמש מעלות צלזיוס לדקה עד 210 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן החזק למשך דקה נוספת כדי להבטיח שספיגת DGLA התרחשה.

לנתח מסגרות על ידי זיהוי יינון להבה או ספקטרומטריית מסה או גילוי MS באמצעות תקנים אותנטיים לזיהוי אלגנטיות הים. תוספת חומצות שומן של דיאטת הים האלגנטית מוגבלת על ידי יכולתו של מקור המזון החיידקי לספוג ולשלב חומצות שומן בקרום החיידקים כדי לקבוע את יכולתו של אי קולי OP 50 להטמיע חומצות שומן שונות בקרומים שלו. OP 50 צופה על מצע ללא תוסף, ריכוזים של 0.1 מילי-מולרי ו-0.3 מילי-מולרי של חומצה סטרית, נתרן אט ונתרן DGLA כפי שניתן לראות באיור זה ניתוח תהילה על ידי GCMS מדגים כי חומצות שומן בלתי רוויות, כולל OLEATE ו-DGLA משתלבות ב-OP 50 ברמות גבוהות יותר מאשר חומצה סטרית של חומצת שומן רוויה.

בנוסף, מדידת כמויות חומצות השומן בתולעים בשלב בוגר מגלה כי לתוספת של חומצות שומן רוויות אין השפעה על הכמות היחסית של חומצות שומן רוויות ברקמות התולעת. עם זאת, תוספת של חומצות שומן בלתי רוויות הגדילה את הכמויות היחסיות של השומנים הללו יחד. נתונים אלה מצביעים על כך שההצטברות היחסית של חומצות שומן בתוספת ב-see elegance נמצאת בקורלציה ישירה עם ההצטברות היחסית של חומצות שומן באי קולי התזונתי.

כפי שהדגמנו בעבר, גרף זה ממחיש את תגובת המינון של השראת DGLA של סטריליות באלגנטיות הים. ריכוז ה-DGLA בשומנים של תולעים בהם 50% מהאוכלוסייה תהיה סטרילית הוא כ-12%ומעניין שהתגובה ל-DGLA יכולה להשתנות על ידי מוטציות גנטיות בתולעים. בהתבסס על ממצא עדכני שמסלולי הלחץ התלויים בגורם גדילת האינסולין יכולים להשפיע על הרס תאי נבט המושרה על ידי DGLA.

השלמנו את התזונה של תולעים המכילות מוטציות מזיקות בקולטן IGF אינסולין שני DAF או בגורם השעתוק DAF 16 FOXO עם DGLA, ניקוד סטריליות בכל זן הראה כי שני מוטציות DAF היו פוריות עם אובדן תאי נבט מושרה מועט או ללא השראה בהשוואה לתולעים מסוג בר בשני ריכוזי ה-DGLA. לעומת זאת, תולעים שקיבלו תוסף DGLA עם ווקס O לא פעיל הראו אחוז גבוה יותר של תולעים סטריליות בהשוואה לסוג הבר כאשר ניזונו מצלחות המכילות 0.15 מילי-מולרית של חומצת השומן. בעקבות הליך זה, חוקרים יכולים לבצע בדיקות רבות עם אלגנטיות הים המשלימה, כגון מחקרי ביטוי גנים, מבחנים התנהגותיים או ניתוחים התפתחותיים או רבייתיים.

בדיקות אלו יחשפו תפקידים לחומצות שומן ספציפיות בתהליכים אלה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין באופן עקבי מדיה בתוספת חומצות שומן שניתן להשתמש בהן כדי לשנות את הרכב חומצות השומן של אלגנטיות הים.