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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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Drosophila Desenvolvimento e Reprodução

Overview

Uma das muitas razões que fazem do Drosophila um organismo extremamente valioso é que os fundamentos moleculares, celulares e genéticos do desenvolvimento são altamente conservados entre moscas e eucariotes mais altos, como os humanos. O progresso da Drosophila através de várias etapas de desenvolvimento em um processo conhecido como ciclo de vida e cada etapa fornece uma plataforma única para pesquisa de desenvolvimento. Este vídeo apresenta cada etapa do ciclo de vida de Drosophila e detalha as características físicas e os principais eventos de desenvolvimento que ocorrem durante cada etapa. Em seguida, o vídeo discute a regulação genética da formação de padrões, que é importante para estabelecer o plano corporal do organismo e especificar tecidos e órgãos individuais. Além disso, este vídeo dá uma visão geral da reprodução de Drosophila, e como usar as características reprodutivas de Drosophila para configurar uma cruz genética. Por fim, discutimos exemplos de como os princípios do desenvolvimento e reprodução da Drosophila podem ser aplicados à pesquisa. Essas aplicações incluem interferência de RNA, ensaios comportamentais de comportamentos de acasalamento e técnicas de imagem ao vivo que nos permitem visualizar o desenvolvimento como um processo dinâmico. No geral, este vídeo destaca a importância da compreensão do desenvolvimento e da reprodução em Drosophila, e como esse conhecimento pode ser usado para entender o desenvolvimento em outros organismos.

Procedure

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Drosophila melanogaster, são amplamente utilizados como um organismo modelo no desenvolvimento e reprodução do estudo. O progresso da Drosophila através de várias etapas de desenvolvimento em um processo conhecido como ciclo de vida e cada etapa fornece uma plataforma única para pesquisa de desenvolvimento. Neste vídeo, apresentaremos os fundamentos do desenvolvimento e reprodução de Drosophila, incluindo como criar uma cruz genética e discutir como essa pesquisa pode ser aplicada para entender processos que vão desde a cicatrização de feridas até o comportamento.

Primeiro, vamos discutir o ciclo de vida de Drosophila. O progresso da drosophila através de 4 estágios principais de desenvolvimento: embrião, larva, pupa e adulto.

O embrião é um óvulo fertilizado que tem cerca de 0,5 mm de comprimento e forma oval. Imediatamente após a fertilização, o embrião sofre rápida divisão mitótica sem crescimento. O núcleo zigolítico sofre nove rodadas de divisão nuclear, mas não sofre citocinese, formando uma célula multi-nucleada chamada blastoderme sinintita. Como todos os núcleos do blastoderme sinintital compartilham um citoplasma comum, as proteínas podem difundir livremente, formando gradientes de morfógenos, que são importantes para estabelecer o plano corporal e padronização de órgãos e tecidos individuais na mosca. Após a 10ª divisão nuclear, os núcleos migram para a periferia do blastoderm sinintítial. Após a 13ª rodada de divisão nuclear, que ocorre aproximadamente 3 horas após a fertilização, os 6000 núcleos na blastodermia sinintítial tornam-se individualizados formando o blastoderm celular. O blastoderme celular contém uma monocamada de células e é transformado em uma complexa estrutura multicamadas, em um processo conhecido como gastrusão. Durante a gastruação, as alterações de forma celular impulsionam as invaginações da monocamada, criando, em última análise, as camadas de endoderme, mesoderme e germe ectoderme. O endoderme dá origem ao intestino, o mesoderme dá origem aos músculos e coração, e o ectoderme dá origem à epiderme e ao sistema nervoso central. Depois de 24 horas, embriões eclodem como larvas.

Larvas são brancas com corpos segmentados semelhantes a vermes. Eles rastejam em torno de comida molhada comendo constantemente, levando a um rápido crescimento. Larvas avançam em três estágios: o primeiro instar por 24 horas, o segundo instar por mais 24 horas e o terceiro instar por 48 horas. A fusão ocorre entre cada etapa. Quando prontas para a pupação, as terceiras larvas instar saem de sua fonte de alimento e se prendem a uma superfície firme, como o lado de um frasco.

Pupa são imóveis e são inicialmente macias e brancas, mas eventualmente endurecem e ficam marrons. Durante um período de quatro dias, tecidos larvais degeneram e tecidos adultos se formam. A eclosão marca o fim do estágio pupal e as moscas emergem como adultas.

8 horas após o encerramento, os adultos se tornam sexualmente receptivos e começam a acasalar, começando o ciclo de vida novamente.

O ciclo de vida completo leva cerca de 10 dias a 25 °C, mas pode ser afetado pela temperatura. Por exemplo, a 18 °C o ciclo de vida é de cerca de 19 dias e a 29 °C, o ciclo de vida é de apenas 7 dias.

Ao longo do desenvolvimento, a cuidadosa regulação genética da formação de padrões estabelece o plano corporal e especifica tecidos e órgãos individuais. É importante ressaltar que o estabelecimento do eixo anterior-posterior define a orientação cabeça a cauda do organismo, e é regulado por diversos grupos de genes.

Em primeiro lugar, os genes de efeito materno são fornecidos no oócito e herdados da fêmea. Eles são importantes no blastoderm siníntial para estabelecer inicialmente o anterior e posterior do embrião. Em particular, o gene bicoide define o anterior do embrião, incluindo a cabeça e o tórax, enquanto o gene nanos define o posterior, incluindo o abdômen.

Em segundo lugar, os genes de segmentação, que são regulados por genes de efeito materno, incluem os genes de lacuna e os genes de regras de pares. Genes de lacuna estabelecem um plano corporal segmentado ao longo do eixo anterior-posterior, subdividindo amplamente o embrião. Os genes de regras par são expressos em um padrão listrado perpendicular ao eixo anterior-posterior, dividindo ainda mais o embrião em segmentos menores. Em seguida, os genes de polaridade do segmento, como engrailed começam a estabelecer destinos celulares dentro de cada segmento.

Por fim, os genes homeóticos são responsáveis pela definição de estruturas anatômicas particulares, como asas e pernas. Curiosamente, a ordem dos genes no cromossomo reflete como eles são expressos ao longo do eixo anterior-posterior.

Drosophila são organismos extremamente férteis que podem produzir milhares de descendentes em toda a vida. As fêmeas depositam centenas de ovos por dia e continuam a fertilizar ovos bem depois que o acasalamento ocorreu.

Drosophila também são organismos sexualmente dimórficos, o que significa que as fêmeas são fenotipicamente distintas dos machos. Em particular, os machos são menores que as fêmeas e têm genitália externa de cor escura, bem como mais pigmento preto em seus abdômens inferiores. Os machos também têm um pedaço de cerdas em suas pernas dianteiras chamadas pentes sexuais usados para prender a fêmea durante a cópula. Essas diferenças fenotípicas distintas tornam muito fácil distinguir machos das fêmeas, o que é particularmente útil na criação de uma cruz genética.

Criar uma cruz com drosophila é uma técnica útil para estudar genética. Então vamos começar!

O primeiro passo para montar uma cruz é coletar fêmeas virgens do genótipo desejado, para que você possa controlar exatamente qual macho com quem ela acasalará. Drosophila não consegue acasalar durante as primeiras 8 horas após o encerramento, por isso coletar adultos muito jovens garante a virgindade. Para coletar fêmeas recém-fechadas, limpe o frasco para o necrotério para se livrar de todos os adultos. A cada 3-4 horas, verifique o frasco para adultos recém-eclosados, e colete as fêmeas em um novo frasco sem machos até estar pronto para uso. As fêmeas virgens são identificadas por sua cor corporal muito clara e uma mancha escura em seu abdômen, conhecido como mecônio.

Quando estiver pronto para começar a cruz, combine 4-6 machos com 4-6 fêmeas virgens de seus genótipos desejados em um frasco de comida datado, e armazene a 25° C e 60% de umidade. Após 3-4 dias, as larvas estarão presentes e os pais devem ser transferidos para um novo frasco, impedindo que os pais acasalem com a prole. Após aproximadamente 10 dias, novos descendentes surgirão e seus fenótipos podem ser examinados.

Uma ferramenta que os pesquisadores de Drosophila usam são cromossomos balanceador que previnem a recombinação genética e contêm marcadores genéticos como asas encaracoladas, que são úteis para determinar o genótipo correto de uma mosca. Se você queria moscas heterozidas para duas mutações diferentes, você pode cruzar um estoque com mutação #1 sobre o cromossomo balanceador CyO, para um segundo estoque com mutação #2 também equilibrado sobre CyO. Qualquer prole que emerge sem asas encaracoladas são heterozigous para ambas as mutações.

Outra ferramenta comumente usada na pesquisa de Drosophila é o sistema UAS-GAL4, que permite aos pesquisadores expressar ou derrubar um gene em um tecido específico. GAL4 é um fator de transcrição de levedura que é impulsionado por um promotor específico de tecido e uas é a sequência de ativação upstream, que controla a expressão do gene de interesse . Quando você cruza uma mosca com um transgene GAL4 específico de tecido para uma mosca com um transgene UAS com seu gene de interesse diretamente rio abaixo, a proteína GAL4 liga o UAS e impulsiona a expressão do seu gene desejado. Por exemplo, o UAS-GFP cruzou para apterous-GAL4, que é específico para os discos de asa em pupa, expressa GFP especificamente nessas células.

Existem muitas aplicações que podem ser usadas para estudar o desenvolvimento e a reprodução de Drosophila. Uma aplicação são análises comportamentais - especificamente comportamento de namoro. Durante o namoro, o macho se orienta em direção à fêmea e a segue enquanto a bate com suas pernas dianteiras. Se a fêmea é receptiva, ela permite que o macho a monte. O macho enrola seu abdômen e transfere fluido seminal para a fêmea, um processo conhecido como cópula. As análises desses comportamentos de namoro em vários mutantes dão uma visão do controle genético do comportamento

O desenvolvimento da drosophila é um processo extremamente dinâmico que inclui muitos movimentos celulares e mudanças de forma, que podem ser estudadas através de imagens ao vivo. Por exemplo, o fechamento dorsal durante a embriogênese é quando uma lacuna no epitélio é fechada de forma semelhante a um zíper envolvendo a coordenação de muitos tipos de células. O fechamento dorsal durante o desenvolvimento é frequentemente usado como modelo para estudar o fechamento de feridas, o que pode ter implicações clínicas.

Uma terceira aplicação usada para entender processos durante o desenvolvimento de Drosophila é a interferência de RNA, que derruba a atividade de genes individuais e pode ser usada em telas genéticas reversas em larga escala. Por exemplo, o dsRNA pode ser injetado em embriões, e o impacto da derrubada genética no desenvolvimento de órgãos, por exemplo, pode ser avaliado. Aqui, a interferência do RNA revelou um gene importante para a fusão durante o desenvolvimento traqueal.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE à reprodução e desenvolvimento de Melanogaster de Drosophila. Neste vídeo revisamos: o ciclo de vida de Drosophila, incluindo detalhes sobre cada etapa de desenvolvimento. Também aprendemos a usar as capacidades reprodutivas do Drosophila para estudar genética e criar uma cruz. Finalmente, aprendemos como o desenvolvimento e a reprodução da Drosophila são úteis para a compreensão de processos complexos como comportamento, fechamento de feridas e desenvolvimento de órgãos.

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