Fácil medição de Difusão Coeficiente de EGFP-tag Plasma Proteínas de Membrana Usando k-Space espectroscopia de correlação de Imagem

O objetivo geral deste procedimento é medir os coeficientes de difusão de proteínas de membrana em células vivas. Isso é feito primeiro cultivando células expressando a proteína marcada com GFP e, em seguida, adquirindo uma sequência de imagens de lapso de tempo em um microscópio de disco giratório com foco definido para a membrana plasmática. A segunda etapa é selecionar um corte na pilha de imagens em que a membrana seja plana e não haja organelas em movimento.

Em seguida, a cultura é analisada usando um software de espectroscopia de correlação de imagem baseado em casos. A etapa final é calcular a média dos gráficos de difusão no Excel. Em última análise, a microscopia de células vivas combinada com kicks é usada para medir o coeficiente de difusão de uma proteína de membrana.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biofísica da membrana, como encontrar os coeficientes de difusão das proteínas da membrana em diferentes condições. Na primeira vez que o código de kicks for usado, abra o MATLAB e clique em arquivo. Em seguida, defina o caminho, clique em adicionar com subpastas e encontre a pasta no computador em que o código de chute está localizado.

Clique em OK. Antes de salvar e fechar o MATLAB durante a aquisição, é importante manter a membrana em foco durante toda a duração da imagem. Selecione uma região retangular de interesse ou ROI na parte plana da membrana onde a fluorescência é distribuída uniformemente.

Exclua organelas celulares em movimento e regiões de membrana salientes. O tamanho da cultura é escolhido para que estatísticas suficientes sejam geradas para bons gráficos K quadrados. Corte a região e salve a colheita como uma tiff.

Arquivo em uma pasta apropriada. Se houver vários cortes do mesmo filme, use um incremento de número, como empilhar um corte, fazer tiff, empilhar um, cortar dois, tif, etc. Para executar a análise, primeiro abra o mat lab e digite ICS gooey na janela de comando e pressione Enter ICS.

GUI é o nome executável para o programa de interface gráfica do usuário de espectroscopia de correlação de imagem no ICS Gooey. Clique na guia de chutes. Encontre a pasta com o nome da pasta, código MATLAB.

Role até o arquivo com os scripts de nome de arquivo e abra-o clicando duas vezes nele. Este arquivo é chamado de editor. In.O editor.

Role para carregar conjuntos de dados de chutes. Em seguida, copie ou digite o nome do arquivo e o local da pasta na linha de comando. Na linha de comando abaixo do local da pasta.

Defina o número de quadros a serem analisados. Use as mesmas configurações para todos os filmes consecutivos na série de dados. Se houver desvio de foco em quadros posteriores.

Estes devem ser excluídos da análise no editor. Clique em salvar e, em seguida, clique em avaliar. Vender o conjunto de dados agora é carregado no software de análise na janela de análise de chutes na gui.

Insira as configurações para a análise desmarcando primeiro as caixas de células T. Em seguida, insira o número de timelag a ser analisado. Insira o K máximo ao quadrado.

Geralmente é entre 20 e 50 Inicialmente. A análise deve ser repetida até que os melhores valores sejam determinados e, em seguida, a configuração deve ser usada para todos os filmes consecutivos na série de dados. Sempre verifique se as configurações selecionadas fornecem um bom ajuste para os dados, conforme evidenciado por um bom gráfico de casos quadrados e um gráfico de difusão linear.

Em seguida, clique em configurações da loja e prossiga. Em seguida, clique em sim para mostrar todos os gráficos. Clique em carregar série de imagens e, em seguida, clique em área de trabalho.

Selecione o corte da série de imagens antes de clicar em importar da área de trabalho. Agora insira as configurações de coleta do sistema de imagem na caixa tamanho do pixel. Insira o tamanho de pixel projetado para o sistema de imagem no qual as pilhas de imagens são adquiridas.

Clique em selecionar ROIs e insira um. Em seguida, clique em OK e use a imagem inteira. Clique em fazer análise de chutes e clique em sim para fazer a filtragem imóvel.

Os resultados serão abertos automaticamente como imagens. Minimize a janela de configurações, minimize a janela de informações da célula e minimize a janela de fotofísica na janela dinâmica. Verifique se o gráfico dinâmico mostra um ajuste linear dos dados para alinhar com uma inclinação negativa, o que significa que os pontos de dados se correlacionam e a difusão livre pode ser assumida.

Registre o coeficiente de difusão para o intervalo de tempo específico e as configurações de K ao quadrado. Os pontos de dados nos gráficos de K quadrados devem ser agrupados em torno da linha pelo tempo determinado. Atrasos, salve os números abertos como imagens e clique em salvar números abertos como imagens para salvar os arquivos de resultado.

Salve em uma nova pasta e clique em limpar dados atuais e continue com a análise do próximo corte. Usando os nomes das culturas conforme definido anteriormente, insira os coeficientes de difusão individuais de cada ROI em uma planilha e certifique-se de anotar o número de intervalos de tempo e os valores de K ao quadrado. Calcule o coeficiente de difusão médio e o desvio padrão usando um programa de planilha.

Realize um teste MOV Smirnoff ou teste T de Student para avaliar as diferenças estatísticas. Usando um nível de significância de 5%, as comparações quantitativas entre as células podem ser abertas. A versão em planilha dos gráficos de difusão, que foi gerada pelo software de análise para cada cultura e calcula a média dos dados para cada condição para cada intervalo de tempo.

Gere um novo gráfico de difusão média para apresentação em trabalhos ou apresentações. Os resultados apresentados aqui são uma sequência de imagens de lapso de tempo de Aquaporin three marcada com EGFP. Em células MDCK vivas, que são células epiteliais renais, fotografadas em um microscópio de disco giratório com foco definido para a membrana plasmática.

Aqui é mostrada uma imagem da célula com exemplos de recortes de ROI destacados em retângulos para a seleção de recortes. É importante cortar na periferia da célula, onde a membrana é uniforme e plana, para que apenas uma difusão bidimensional seja visualizada. Organelas celulares, vesículas e projeções de membrana devem ser evitadas, e é importante para a análise que não haja desvio durante o lapso de tempo.

Esta cultura representativa foi excluída da análise e kicks, pois existem vesículas em movimento, o que pode contribuir para o coeficiente de difusão. Outro exemplo de uma cultura excluída em que há um buraco na membrana é mostrado aqui. O gráfico de difusão de uma cultura gerada com chutes é apresentado aqui.

Este método pode ser usado para encontrar o coeficiente de difusão de uma proteína marcada com proteína fluorescente, um corante ou pontos quânticos. A inclinação da curva no gráfico de difusão é simplesmente o negativo do coeficiente de difusão mostrado aqui para Aquaporina três marcado com EGFP mostrado aqui é um gráfico de difusão calculado com muitos intervalos de tempo. Nesse caso, a análise foi refeita, mas com menos defasagens de tempo para que o gráfico de difusão seja linear.

Um gráfico típico de casos quadrados é apresentado aqui. Esta é a média radial e a curva de correlação transformada em logaritmo para um intervalo de tempo selecionado a partir desses gráficos de K quadrados. A inclinação é plotada versus defasagens de tempo, e o resultado é o gráfico de difusão mostrado anteriormente.

Ao inspecionar os gráficos de K quadrados, é importante que o ajuste seja avaliado a partir desse gráfico de K quadrados. Pode-se concluir que a cultura é muito pequena e não pôde ser analisada, pois deve ter uma inclinação negativa e decair linearmente para um piso de ruído. Este gráfico de K ao quadrado precisa ser reanalisado com um valor máximo reduzido de K ao quadrado, uma vez que o ajuste não é mais bom, conforme julgado pelos resíduos crescentes em valores maiores de K ao quadrado.

Nesse caso, a análise deve ser executada novamente, inserindo um valor máximo K quadrado inferior. Um gráfico de difusão médio em média em 10 culturas é mostrado aqui. O gráfico de difusão foi encontrado no arquivo Excel da análise e dele.

O coeficiente de difusão AQUAPORIN three EGFP é calculado seguindo este procedimento. Outros métodos, como medir o coeficiente de difusão de proteínas de membrana após a adição de diferentes drogas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como as alterações do coeficiente de difusão após o tratamento medicamentoso e se é provável que haja mudanças nos ambientes lipídicos e/ou interações proteicas na membrana.