Un Modelo Anoxia inanición por isquemia / reperfusión en el C. elegans

El objetivo general de este procedimiento es imitar la reperfusión de la isquemia en el mar. Esto se logra moviendo la elegancia del mar a un micro túbulo y lavando las bacterias. El segundo paso es crear un entorno anóxico.

Usando una cámara hipóxica hecha en laboratorio, los animales se someten a anoxia durante 20 horas y luego se colocan en condiciones aeróbicas después de 24 horas. El paso final es anotar para los animales muertos y anotar para la respuesta táctil. Las modificaciones neuronales también se observan a través de la microscopía de fluorescencia.

En última instancia, la anoxia por inanición en el mar se utiliza para crear las mismas condiciones que se ven en la isquemia, la lesión en eucariotas superiores en un modelo genético más fácil y flexible, y las ventajas de estas técnicas sobre los métodos extintos de fusión de repetición isquémica en células aisladas de corazones es que C elegance es un modelo genético muy poderoso y también es un transporte. Los organismos te permiten usar varios fluidos y técnicas diferentes. Además de eso, le estamos mostrando cómo, en lugar de usar una cámara de hipoxia o ambiental costosa para usar una cámara de hipoxia y ambiental de laboratorio, eso solo costará unos pocos dólares.

En general, las noticias individuales en este asunto deben tener en cuenta algunos puntos clave como, por ejemplo, purgar los tampones y tener mucho cuidado con la puntuación de los gusanos y también ser constante con la cantidad de temperatura que se está utilizando y la cantidad de oxígeno. Todos estos puntos pueden cambiar el resultado del experimento Para preparar una cámara hipóxica personalizada, un contenedor hermético hermético hermético estilo Tupperware se puede adaptar como una cámara anóxica. Seleccione el recipiente más pequeño posible, ya que un recipiente pequeño crea un ambiente hipóxico más rápido y es más fácil de colocar en el baño de agua.

Haga dos orificios en la tapa que tengan el tamaño adecuado para acomodar un conector de plástico o metal que se ajuste al tubo, asegúrelo en su lugar con pegamento que se pueda colocar bajo el agua y que también se endurezca después del secado, evitando el movimiento del conector y, por lo tanto, reduciendo la posibilidad de fugas. Alternativamente, se puede usar una arandela de neopreno para ayudar a sellar el conector al contenedor. Coloque el recipiente en el baño de agua para que quede completamente sumergido.

Para sumergir el recipiente. Use una pesa de botella o una pesa de buceo. Una de las conexiones del tubo se utilizará para introducir una mezcla de gases y el otro tubo actuará como alivio de presión.

Por lo tanto, debe dejarse bajo el agua para que el recipiente quede sellado del ambiente externo. Para comenzar a cultivar la elegancia como se describe en el protocolo de texto, prepare un tampón M nine y purgue el oxígeno equilibrándolo con nitrógeno 30 minutos antes del experimento y manteniéndolo rodeado de hielo. Haga un pequeño agujero en la tapa de los tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros en el que se colocarán los gusanos durante la inanición por anoxia.

El orificio permite el intercambio de gases sin mantener la tapa abierta, lo que puede provocar una evaporación excesiva del medio. Agregue un mililitro de tampón M nine oxigenado a temperatura ambiente a cada placa de 35 milímetros que contenga gusanos adultos jóvenes. Tenga cuidado de evitar eliminar las bacterias del plato.

Después de aproximadamente un minuto, los gusanos deberían estar nadando en el M nueve. Siguiente capa, una punta de pipeta de un mililitro con albúmina sérica bovina o BSA pipeteando y expulsando una solución estéril de BSA al 1%. Incline con cuidado la placa que contiene los gusanos en el tampón M nine y retire el M nine del mismo lugar donde se agregó.

A continuación, coloque la suspensión en los tubos de microcentrífuga preparados. Deje reposar las muestras en hielo hasta que los gusanos hayan caído al fondo de los tubos. Retire la cantidad máxima de M nueve posible sin molestar a los gusanos del tubo.

Luego agregue un mililitro del oxígeno M nine purgado y congelado, y coloque el tubo sobre hielo hasta que los gusanos se asienten en el fondo. Otra vez. Repita este paso de lavado tres veces en el último lavado. Retire el M nine hasta que queden aproximadamente 100 microlitros en el tubo.

A continuación, coloque los tubos con los gusanos en tampón M nine desoxigenado en la cámara y selle la cámara con el gas de la tapa con un flujo de nitrógeno constante de 100 mililitros por minuto. Coloque el recipiente dentro de un baño de agua a 26 grados centígrados. Asegúrese de que el tubo de salida esté bien sumergido en agua para que no regresen aires y no haya fugas en el sistema.

Proceda a incubar los gusanos a 26 grados centígrados durante 20 horas siguiendo la incubación pipeteando sea elegance con una punta recubierta de BSA en una placa de medio de crecimiento de nematodos de 35 milímetros. Incubar las placas a 20 grados centígrados durante 24 horas. Después de esto, los gusanos estarán listos para anotar.

Con una púa de platino, toque ligeramente la parte superior de la cabeza del gusano Live. Los gusanos se moverán hacia atrás después de ser tocados si los gusanos no responden, se marcarán como muertos. Ocasionalmente, un gusano no se moverá hacia atrás, pero puede exhibir un ligero movimiento de cabeza de lado a lado, aunque técnicamente no están muertos, es casi seguro que estos gusanos caducarán en cuestión de horas y deben marcarse como muertos.

Repita este paso de 10 a 15 veces para cada gusano con intervalos de diez segundos. Pruebe al menos 10 gusanos en cada grupo para tener datos precisos para visualizar la inanición posterior a la anoxia, las modificaciones neuronales. Utilice una cepa que exprese proteína verde fluorescente o GFP en las neuronas mecánicas que responden al tacto.

Coloque una gota de solución de ARO al 2% en un portaobjetos de vidrio que se haya colocado entre otros dos portaobjetos que tengan una sola pieza de cinta adhesiva en su parte inferior. Coloque un portaobjetos de vidrio final perpendicular al primero encima de la solución de ARO al 2% y déjelo enfriar a temperatura ambiente. Esto debe formar una almohadilla del grosor de la cinta.

A continuación, retira el portaobjetos superior y añade 10 microlitros de M nine que contengan un 0,1% de tetra aole, lo que inmovilizará los gusanos. Mueva unos 10 gusanos vivos en el portaobjetos 2%aro y coloque un cubreobjetos sobre ellos. Visualice la GFP utilizando un microscopio de fluorescencia bajo un objetivo de 100 x con la iluminación adecuada.

Las neuronas dañadas mostrarán un patrón de collar de perlas en la membrana citosólica en los procesos compuestos por múltiples puntos y/o anomalías donde los procesos parecen estar rotos. Cuente el punctum y las anomalías en ambas neuronas para cada gusano utilizando un total de al menos 10 gusanos. Someter a Sea Elegance a 20 horas de anoxia e inanición a 26 grados centígrados en una cámara de incubación hecha a medida en laboratorio resultó en una mortalidad significativa.

Los supervivientes también respondieron mal al contacto ligero con la pared del cuerpo. Las imágenes fluorescentes posteriores de puncto y roturas en los procesos neuronales marcados con GFP de los sobrevivientes confirmaron la presencia de anomalías morfológicas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo promover la isquemia.

Una observación en cámaras hipóxicas hechas en el laboratorio y también debería ser capaz de medir la muerte y también las modificaciones neurológicas en la elegancia de Seattle. Este modelo ha sido utilizado por múltiples grupos para estudiar cómo en las intervenciones naturales y el metabolismo pueden influir en las condiciones hipóxicas de vida y muerte.