Overview
O zebrafish (Danio rerio) é um poderoso sistema de modelos vertebrados para estudar o desenvolvimento, modelar doenças e triagem para novas terapêuticas. Devido ao seu pequeno tamanho, um grande número de zebrafish pode ser alojado em laboratório a baixo custo. Embora os zebrafish sejam relativamente fáceis de manter, deve-se considerar especial tanto a dieta quanto a qualidade da água para otimizar a saúde dos peixes e o sucesso reprodutivo.
Este vídeo fornecerá uma visão geral da criação e manutenção de zebrafish no laboratório. Após uma breve revisão do habitat natural de zebrafish, serão discutidas técnicas essenciais para a recriação desse ambiente em laboratório, incluindo elementos-chave dos sistemas de recirculação de água das instalações de peixes e a preparação do camarão salgado como parte da dieta dos zebrafish. Além disso, a apresentação incluirá informações sobre como cepas específicas de zebrafish são rastreadas em um ambiente de laboratório, com referência específica à coleta de amostras de barbatanas de cauda para extração de DNA e genotipagem. Finalmente, modificações experimentais do ambiente de zebrafish serão discutidas como um meio de aprofundar nossa compreensão desses peixes e, por sua vez, nós mesmos.
Procedure
A pecuária adequada é essencial para o sucesso de experimentos realizados em zebrafish. A qualidade ideal da água promove a saúde dos peixes e a reprodutibilidade experimental. Além disso, a produção de ovos de zebrafish é altamente dependente da nutrição adequada. Este vídeo descreve como os peixes são alojados e alimentados no laboratório, dicas sobre como manusear e gerenciar estoques e um vislumbre de como o ambiente de zebrafish é manipulado em experimentos biológicos.
Vamos começar redoeando o básico do habitat dos peixes.
Zebrafish selvagens são originários de águas frescas do Himalaia. Nesse clima, os peixes passam a maior parte de seus dias se aquecendo em corpos lentos de água doce.
Como esse paraíso é recriado no laboratório? Vamos começar com a parte mais importante: a água. Embora a água doce possa parecer fácil de obter, a água da torneira é tóxica para os zebrafish por causa do cloro e potenciais contaminantes. Portanto, a água do aquário deve ser passada através de um sistema de purificação, como uma unidade de osmose reversa. Sais e tampões de pH são então adicionados de volta à água purificada para otimizar a salinidade e o pH.
Para maximizar a eficiência experimental, muitos peixes são mantidos em uma quantidade limitada de água. Os resíduos se acumulam rapidamente com todos aqueles peixes nadando ao redor, tornando a mudança de água essencial. Essa necessidade cria uma alta demanda de água, por isso as instalações de peixes utilizam um sistema de recirculação para minimizar o uso da água. A água suja é filtrada e esterilizada pelo tratamento UV antes de fluir de volta para o sistema.
Os zebrafish são mantidos em tanques especializados, que estão disponíveis em vários tamanhos. Os tanques são cobertos para reduzir a evaporação e evitar a fuga de peixes. Para permitir que o tanque se integre ao sistema, a tampa tem furos através dos quais a água limpa está constantemente fluindo. O nível da água permanece estável graças a um porto de transbordamento na parte de trás do tanque, que é coberto por um defletor com pequenos buracos que permitem que a água suja, mas não os peixes, fluam.
Apesar da troca de água, algas e resíduos sólidos ainda podem se acumular nos tanques, por isso precisam ser limpos regularmente.
O controle ambiental em instalações de peixes também é extremamente importante. A temperatura é mantida perto de 28 °C, ou 80 °F. Para manter o ritmo circadiano dos animais, as luzes são controladas em um ciclo com 14 horas de luz e 10 horas de escuridão.
Agora que superamos as condições de moradia de zebrafish, vamos falar sobre a dieta deles.
Em seu habitat natural, os zebrafish consomem em grande parte zooplâncton e insetos. Esta dieta é recriada em laboratório por uma combinação de alimentos secos e pequenos organismos. Peixes larvais e juvenis prosperam em microrganismos vivos como paramecia, enquanto peixes adultos são frequentemente alimentados comercialmente por pós disponíveis comercialmente e pequenos crustáceos conhecidos como camarão de salmoura.
Estas criaturas são particularmente favoráveis à preparação de laboratório, porque seus ovos podem ser armazenados como cistos dormentes à temperatura ambiente. Para preparar o camarão para comer, suas conchas externas duras são removidas pelo tratamento com alvejante. Em seguida, os ovos descapsulados são lavados completamente. Os ovos são então transferidos para uma torre arejada para permitir o crescimento da água salgada por cerca de um dia. Finalmente, o camarão eclodido é coletado e enxaguado em um coador de malha e, em seguida, colocado em garrafas para alimentação. Os peixes são geralmente alimentados 2 - 3 vezes por dia, alternando alimentação ao vivo e seca, e o fluxo de água é desligado durante este período para que o alimento não flutue para longe antes de ser comido.
Agora que você sabe como abrigar e alimentar peixes, é hora de aprender a trabalhar e manter o controle de seus estoques de peixes.
Instalações de peixes de laboratório abrigam muitos tipos diferentes de zebrafish, desde cepas de tipo selvagem, até peixes cujos genomas foram modificados com mutações de pontos disruptivos e transgenes inseridos. Para acompanhar todos esses peixes, animais com formação genética semelhante são mantidos juntos em tanques rotulados. Os rótulos dos tanques devem conter informações de identificação minuciosas, incluindo o genótipo do peixe e a data de nascimento.
A fertilidade dos zebrafish começa a diminuir após o primeiro ano de vida, por isso os estoques devem ser repostos anualmente. Os zebrafish não sobrevivem bem como cepas totalmente inseridas, por isso a diversidade genética deve ser mantida coletando descendentes de cruzes de peixes não relacionados, ou "outcrosses".
Ao superar linhas transgênicas ou mutantes, a prole com a modificação genética desejada deve ser identificada pela expressão fluorófora ou genotipagem. Para genótipo, primeiro anestesiar o peixe em tricaine. Então, corte um pequeno pedaço da barbatana da cauda como fonte de DNA.
Finalmente, isole o DNA da amostra da cauda e use-o para análise de PCR para identificar sequências específicas. Enquanto espera pelos resultados, mantenha cada peixe em seu próprio pequeno tanque rotulado com um identificador.
Agora que superamos as condições padrão de criação de peixes, vamos ver algumas maneiras de que esses padrões sejam manipulados para estudar processos biológicos.
A temperatura da água do sistema pode afetar profundamente a saúde dos zebrafish. Para criar um modelo de diabetes mellitus, esses pesquisadores tratam os peixes com a toxina pancreática, estreptozocina, e os abrigam em tanques com temperatura reduzida da água. Os peixes diabéticos apresentam fenótipos esperados, como danos nos rins e oculares, bem como redução da regeneração da barbatana de cauda, e podem ser usados para examinar a biologia do diabetes.
Os sistemas de tanques também podem ser modificados para fins experimentais específicos. Estudos sobre o comportamento da natação em peixes podem ser usados como leitura para ansiedade, agressão ou comportamentos sociais. Aqui, o rastreamento de vídeo é usado para analisar a diferença no comportamento de natação entre peixes não tratados e aqueles tratados com uma droga neuroativa. Estudos como esses ajudam a avançar nossa compreensão da neurociência e podem ser uma ferramenta para a descoberta de drogas.
Condições de luz alteradas também podem afetar o zebrafish. O tratamento intenso da luz pode até ser usado para ablatar as células de detecção de luz da retina. Esses peixes têm a capacidade de reparar tecido retiniano danificado por proliferação celular, o que é de interesse significativo para os cientistas que pesquisam a degeneração da retina nas pessoas.
Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre manutenção de zebrafish e criação. Nós passamos por cima do essencial de como os peixes são alojados, alimentados e gerenciados em laboratório. Obrigado por assistir!
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
