Aip1pダイナミクスはアクチンにおけるR256H変異によって変更される

この手順の全体的な目標は、変異型アクチンアイソフォームを発現する酵母のアクチン結合タンパク質の動きを視覚化することです。これは、まずプラスミドを作製し、アクチン相互作用タンパク質1またはIP1に3×緑色蛍光タンパク質Fluor fourでタグ付けされたP遺伝子をコーティングすることによって達成される。第2のステップは、野生型または変異型アクトンのみを発現する酵母株を生成することである。

次に、GFPタグ付きA IP one Pプラスミドを野生型または変異酵母株に形質転換します。最後のステップは、野生型および変異酵母細胞におけるタグ付きA IP one Pの動きを画像化し、解析することです。最終的には、完全な内省です。

蛍光顕微鏡または芝顕微鏡を用いて、R 2 56 H変異アクトンを発現する酵母では、A IP one Pが野生型アクトンよりもゆっくりと移動することを示します。この方法は、結合パートナーの相対的な時間的動きなど、細胞骨格領域における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法を最初に思いついたのは、野生型株とは異なり、変異酵母株からA IP one Pを削除すると致死的であることを発見したときです。

共焦点顕微鏡法などの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、コントラストとイメージング速度の向上です。一般に、この方法を初めて使用する人は、多数の調整を行うことができ、画像品質の主観的な性質のために、個々の実験の顕微鏡設定を最適化するのに苦労する可能性があります。このプロトコルは、テキストプロトコルの指示に従ってA IP one PGFPプラスミドおよび変異酵母株の生成から開始し、制限酵素でプラスミドを消化して酵母染色体培養に組み込みます。

調製されたS-C-V-C-A細胞は、摂氏30度のホイール上の5ミリリットルのYPD培地で一晩中ウラシルを合成することができません。細胞の1ミリリットルを1000倍gで5分間スピンダウンします。次に、テキストプロトコルの指示に従ってプレート混合物を作成し、細胞から上清をろ過滅菌デカントし、残りの液体中の細胞を懸濁細胞に再懸濁します。

ミリリットルあたり10ミリグラムの2マイクロリットルをサケ精巣キャリアDNAに加えます。次に、消化したプラスミド、DNA、ボルテックスを10マイクロリットル加えてから、0.5ミリリットルのプレートを加えて再びボルテックスします。最後に、20マイクロリットルの1モルDI 3エトールとボルテックスを追加します。

混合物を摂氏25度で6〜8時間インキュベートした後。細胞を摂氏42度の水浴中で10分間熱ショックします。マイクロ遠心チューブの底から100マイクロリットルの細胞をプレートにセットし、そこで細胞がマイナスUプレートに沈殿します。

摂氏30度で2〜3日間、またはコロニーが形成されるまでインキュベートします。個々のコロニーを選択し、マイナスに縞模様になります。食べた。顕微鏡検査の準備をするために、これらの細胞にはプラスミドが含まれており、A IP one GFPとUroGenが染色体に組み込まれています。

YPDに組み込まれたA IP one PGFPを30°Cのホイールで一晩酵母細胞の培養物を増殖させます。一晩の文化の1ミリリットルをマイナスユーロメディアの9ミリリットルに。細胞を摂氏30度のシェーカーでさらに3〜4時間増殖させ、細胞が丸太成長段階にあることを確認します。

次に、ガラス製の顕微鏡スライドに3マイクロリットルの細胞を加え、カバースリップを追加します。セルがスライド上に5分間落ち着くのを待ちます。スライドをステージプレートのブラケットにセットする前に、油浸100 x 芝対物レンズとデジタルCCDカメラを使用して、全反射蛍光または芝顕微鏡でA IP one PGFPタンパク質を観察します。

セルにフォーカスするには、スライドブック5.0ソフトウェアを開き、ツールバーのフォーカスウィンドウボタンをクリックします。フォーカスコントロールにアクセスするには、スコープタブを選択し、100 x turf対物レンズを選択します。ランプをオンにして、ランプバーを15%にスライドさせますビンの設定を2つずつに変更し、顕微鏡でフィルターを明視野に変更します。

ファインフォーカススタイルを使用して、コンピューター画面に表示されているようにセルにフォーカスを合わせます。フォーカスウィンドウ内のコントロールを使用して、ランプをオフにし、フィルターをライブに変更して、顕微鏡の右側ポートに取り付けられたT-I-R-F-MイルミネーターのT-I-R-F-Mボタンをクリックします。レーザー放射をオンに切り替え、フォーカスウィンドウ内のストリームタブを選択します。

[録音を開始する]の横にあるチェックボックスをオンにしてから、TIRFMイルミネーターの明視野ボタンをクリックします。マイクロメータを回して、レーザーの入射角を調整します。これは、A IP one GFP病巣からの蛍光発光を最適化し、細胞からのバックグラウンドインフルエンザ蛍光を最小限に抑え、目的の画像が表示されるときにスライドするために使用されます。

スタートを押します。毎秒5フレームの速度で20秒間の画像を取得します。20秒後、停止を押します。

メインメニューバーのファイルタブで画像を保存します。「スライドに名前を付けて保存」を選択し、ファイル、場所、名前を入力します。次に、Image Jソフトウェアを使用します。

画像を解析するには、マクロプラグインのマニュアルトラッカーを使用して、蛍光A IP one P病巣の動きと速度を追跡します。時間間隔パラメーターを 0.2 秒に変更します。add track selectionを使用して、個々の蛍光タンパク質を4〜8個の結合フレームで選択し、追跡します。

N trackコマンドを使用すると、各フレーム間のタンパク質移動速度が結果ウィンドウに表示されます。各フレーム間の平均レートを決定します。Microsoft Excel スプレッドシートを使用する。

これらの値を使用して、IP 1 P 移動の平均速度を計算するか、対象の各細胞株を使用して A IP 1 P 移動を定量化します。50以上の蛍光A IP one P病巣を10以上の細胞で追跡しました。野生型細胞におけるIP one P移動の代表的な結果は、予想通りに示されています。

蛍光タグ付きのIP one Pは、細胞上を素早く移動し、R 2 56 H変異体Actonを発現する細胞内で消失します。IP one Pは、野生型細胞に比べて動きが少ないです。IP one Pは、画像Jを使用して追跡され、タンパク質の動きを定量的にマッピングします。

IP one Pは、野生型株の細胞を横切って範囲を広げますが、制限された領域でのみ移動します。変異体アクトン株では、各蛍光A IPの1つのP領域について平均速度を計算した。野生型細胞では、IP one Pの平均移動速度は、アクチン細胞骨格の異常な形態を有することが知られているR2 56H変異アクチンを発現する細胞が、変異株においてA IP one P表現型が変化したA、IP1、Pの表現型を有する、1秒当たり1.60±0.42ミクロンである。

IP one Pの動きは制限されており、遅くなります。A IP one Pの動きの平均速度は0.88で、毎秒プラスマイナス0.30ミクロンです。このビデオを見れば、芝顕微鏡を使用して細胞骨格タンパク質をイメージングする方法を十分に理解できるはずです。

この手順を使用するときは、細胞を乾燥させたり、光漂白したりしないように注意することが重要です。